磷脂包覆的Fe3O4纳米颗粒实现豆天蛾幼虫血淋巴中推定抗菌肽的快速筛选

《Antibiotics》：Phospholipid-Coated Fe3O4 Nanoparticles Enable Rapid Screening of Putative Antimicrobial Peptides from Clanis bilineata tsingtauica Hemolymph

　　

抗菌肽（AMPs）在昆虫血淋巴中是传统抗生素的有希望的替代品，但很难从复杂的生物基质中快速筛选它们。本研究旨在开发一种简单且高效的方法，用于从豆天蛾幼虫的血淋巴中富集和初步鉴定推定的AMPs。使用飞行时间质谱法从屎肠球菌中鉴定出的膜磷脂制备了磷脂包覆的磁性纳米颗粒（Fe₃O₄@L）。在纳米颗粒表征后，优化了富集条件，并将Fe₃O₄@L工作流程与传统的超滤-电泳-银染-质谱法（UESM）进行了比较。通过从头质谱法鉴定肽，随后进行序列过滤、重复筛选和计算机AMP预测。对候选肽进行了化学合成，并评估了其抗菌活性、最低抑菌浓度（MIC）、生长抑制、形态效应和溶血活性。Fe₃O₄@L方法的优化使得富集组分中的肽浓度增加了1.86倍。与UESM相比，Fe₃O₄@L将工作流程从四步减少到三步，并将处理时间缩短了61.2%。从头分析生成了724个过滤后的肽，其中58个在至少两次重复中被可重复地检测到，在活性预测后产生了五个推定的AMPs；在相同条件下，UESM未鉴定出推定的AMP。在合成的肽中，CBT-3对屎肠球菌和大肠杆菌表现出抗菌活性，MIC分别为32和64 mg/L，并且对人红细胞的溶血活性较低。Fe₃O₄@L提供了一种从昆虫血淋巴中初步筛选AMP的简单且有效的策略，并且CBT-3是一个有希望进行进一步研究的肽候选物。

昆虫体内含有的抗菌肽（AMPs）是抗感染药物和抗生素替代品的重要来源，其相较于传统抗生素不易引发残留问题。豆天蛾是中国江苏特有的食用昆虫，其内源性生物活性肽在食品和医药领域极具开发潜力，但对该昆虫天然AMPs的研究依然有限。由于昆虫血淋巴等生物基质成分复杂，直接分离纯化AMPs需要进行繁琐的预处理和多步色谱纯化，导致样品损耗大、操作复杂且整体分离效率低下；而基于生物信息学的转录组数据预测方法仍需实验验证以确认其自然表达。鉴于大多数AMPs带有正电荷，能在静电引力作用下优先与细菌细胞膜上带负电的磷脂相互作用，发生膜结合进而导致细菌死亡，研究人员推测病原菌的膜磷脂能够作为亲和基础，用于富集和初步筛选对膜具有亲和力的AMPs。然而，单独的磷脂难以直接用作分离材料，需要借助具有高比表面积和良好生物相容性的磁性纳米颗粒作为载体。因此，研究人员开展了相关研究，旨在开发一种受病原菌膜启发的磁性富集策略，实现天然AMPs的快速预筛选，研究结论得出该策略极大简化了操作流程并成功筛选出具有开发潜力的候选肽，这对于复杂基质中新型抗菌药物的发现具有重要意义，该论文已发表在《Antibiotics》期刊上。

本研究所用样本来源于在江苏省农业科学院饲养的豆天蛾5龄幼虫样本以及分离自感病蛹的屎肠球菌菌株。为开展研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先使用飞行时间质谱法（TOF-MS）鉴定屎肠球菌的膜磷脂成分，并通过一锅共沉淀法制备磷脂包覆的Fe₃O₄纳米颗粒（Fe₃O₄@L）；随后利用透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）和热重分析（TGA）等多维分析手段对纳米颗粒的形貌、粒径、官能团、晶体结构和热稳定性等理化性质进行系统表征，同时优化了纳米颗粒用量、吸附时间、洗脱时间、pH和温度等富集条件；最后结合数据库非依赖性的从头测序质谱分析、抗菌活性预测以及扫描电子显微镜（SEM）观察，对所获肽序列的生物学功能进行验证和评估。

Fe₃O₄@L涂层材料的鉴定
通过提取对豆天蛾幼虫具有高致病性的屎肠球菌的细胞膜磷脂作为包覆材料，并经过TOF-MS分析比对，初步鉴定出四种候选磷脂。该包覆策略利用了静电相互作用以及脂质尾部之间的疏水相互作用，有利于纳米颗粒表面对目标肽的吸附。

Fe₃O₄@L纳米颗粒的表征
通过共沉淀法合成的Fe₃O₄@L表现为不规则团聚形貌，水合直径保持在纳米尺度。FTIR和TGA等分析证实了磷脂层在氧化铁核心外表面的成功修饰，同时XRD结果显示包覆过程保留了铁氧化物的晶型结构。蛋白吸附性能测试表明该纳米颗粒具备良好的吸附与回收效率。

Fe₃O₄@L纳米颗粒优化肽富集
通过测量不同条件下洗脱液中的肽浓度，研究人员确定了最佳富集条件，此时富集组分中的肽浓度增加了1.86倍。该优化过程以洗脱液中总肽浓度作为响应指标，旨在提高从血淋巴基质中回收肽的整体效率。

Fe₃O₄@L纳米颗粒的可重复使用性
经过多次吸附分离循环测试，结果显示前两次循环中肽富集效率保持稳定，但在后续循环中逐渐下降，至第四和第五次运行时浓度显著降低，表明其经过多轮使用后涂层功能会出现不可逆的损耗。

Fe₃O₄@L方法与UESM方法的比较
与传统UESM方法相比，Fe₃O₄@L工作流程从四步缩减至三步，总处理时间大幅缩短了61.2%。在质谱分析中，Fe₃O₄@L法所产生的候选肽序列数量远超UESM法，并且仅在Fe₃O₄@L产物中鉴定到了推定的AMPs，彰显了其在通量和操作简便性上的显著优势。

推定AMPs的鉴定
利用从头测序，研究人员在三次独立重复中获得总数为724个过滤后的肽段，并保留在至少两次重复中均检测到的58个肽，最终预测出五个推定的AMPs。这些序列长度均小于10个氨基酸并带有正电荷，其二、三级结构多呈α-螺旋。而UESM法未鉴定出具有抗菌潜力的序列。

肽富集组分及合成推定AMPs的抗菌活性
抑菌圈实验表明，血淋巴及Fe₃O₄@L富集组分均对屎肠球菌产生明显的抑菌圈。由于天然肽含量有限，研究人员合成了五种候选肽进行测试，发现仅CBT-1和CBT-3表现出抗菌活性。其中，CBT-3对屎肠球菌和大肠杆菌的最低抑菌浓度（MIC）分别为32和64 mg/L，因此被选为后续研究的主打候选物。生长抑制测定显示在0.5至2 × MIC浓度下CBT-3均能够有效抑制细菌生长，且呈浓度依赖性。SEM观察得出CBT-3能严重破坏两种细菌的细胞表面形态，致使其发生扭曲、褶皱及局部塌陷等变形现象。

溶血活性与初步生物安全评估
对人红细胞的溶血测定显示，在1至128 mg/L浓度范围内，CBT-3处理的细胞上清液未见明显红色，且溶血率均低于3%。在其对应的MIC浓度下，溶血率极低，表明该肽对人红细胞具有极低的毒性伤害作用，具备良好的生物安全性。

讨论部分总结指出，Fe₃O₄@L平台通过将静电吸引与疏水插入相结合模拟细菌膜环境，实现了对膜活性肽的有效吸附，非常适宜作为生物仿生筛选工具。该平台在肽的提取步骤、处理时间和下游质谱兼容性方面均远优于传统UESM方法，极大减轻了操作负担。研究发现所鉴定序列均为带有正电荷的短肽，其作用与天然AMPs特征相符。其中CBT-3表现出显著的抗菌效能和低溶血毒性，对临床具有多重耐药性的屎肠球菌展现出潜在的治疗价值。然而，受限于病原菌膜成分的多样性，当前平台对AMP的选择性富集一定程度上具有物种依赖性，其适用于快速预筛选推定AMP而非实现绝对纯化。未来仍需进一步补充如加标控制等实验以AMP的选择性进行更严谨的评估，并验证CBT-3更广泛的抗菌谱和体内安全性。

研究结论部分翻译如下：本研究开发的Fe₃O₄@L方法能够实现对豆天蛾幼虫血淋巴中推定AMPs的高效、快速筛选。该方法具备操作简单、磁性颗粒易于回收和富集步骤精简的特征，非常适合用于AMP的初步鉴定。通过从头测序和计算机模拟预测，研究人员鉴定出了五种推定的AMP序列。其中，CBT-3对屎肠球菌和大肠杆菌均表现出抗菌活性，能引发细菌细胞形态改变，且在实验条件下对人红细胞的溶血活性较低。这些结果证实了Fe₃O₄@L方法在AMP发现中的应用价值，并提示CBT-3是一个极具潜力的进一步研究对象。尽管如此，依然需要开展更多研究以阐明CBT-3的抗菌机制，评估其更广泛的生物活性及体内安全性，同时其余推定AMPs仍有必要进行后续的实验验证。