肠道定植的克罗诺杆菌属可在不穿越宿主屏障的情况下破坏中枢神经系统

《Gut Microbes》：Enteric-colonized Cronobacter spp. can disrupt the central nervous system without translocation across the host barriers

　　

阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）是一种机会性食源性病原体，已知可引起严重的新生儿感染。然而，其对人类健康的亚临床影响在很大程度上仍未探索。在此，研究人员报告，在缺乏细菌穿越宿主屏障的情况下，肠道定植的克罗诺杆菌（Cronobacter）可能与人类神经行为改变相关。对GUSTO（Growing Up in Singapore Towards Healthy Outcomes）队列儿童粪便微生物群的分析显示，克罗诺杆菌丰度与其情绪反应性（Emotionally Reactive）和情感问题（Affective Problems）评分呈显著正相关，提示肠道克罗诺杆菌定植与情绪功能障碍之间存在关联。利用斑马鱼（Danio rerio）幼体模型，研究人员证明，阪崎克罗诺杆菌ATCC 25944的肠道定植引发了独特的弯曲表型和运动不稳定性，表明中枢神经系统（CNS）紊乱。多组学分析揭示了与昼夜节律（circadian rhythm）相关的基因（如per2、nr1d1、nr1d2）和神经精神标志物（hint1）的上调，以及涉及与神经退行性应激相关的脂质类别的代谢失调。随机诱变结合全基因组测序（WGS）鉴定出与脂多糖（LPS）生物合成和菌毛粘附相关的基因中的修饰子（modifier）变异，这些变异减弱了神经毒性表型。从野生型阪崎克罗诺杆菌中分离的LPS（而非突变体中的LPS）再现了CNS损伤表型，突出了其关键的毒力作用。总之，研究人员的发现提供了首个证据，表明肠道克罗诺杆菌定植可能通过肠道来源的LPS信号影响人类情绪发展，强调了其在肠脑轴（gut–brain axis）和神经行为健康中被低估的作用。

研究背景：克罗诺杆菌属（Cronobacter）属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae），其中阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）是最常见的临床分离种，可引起新生儿坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis）、脑膜炎（meningitis）和败血症（septicemia），致死率高。然而，该菌在健康个体中也有携带，其肠道定植而不穿越肠屏障和血脑屏障（blood-brain barrier）是否会对人类健康造成慢性损害尚不清楚。鉴于急性感染主要影响中枢神经系统（CNS），研究人员假设该菌具有神经趋向性，并探讨肠道定植的亚临床效应。该研究发表于《Gut Microbes》。

研究人员开展的研究：利用新加坡GUSTO（Growing Up in Singapore Towards Healthy Outcomes）队列中469名儿童的粪便微生物群16S rRNA基因测序数据和儿童行为量表（CBCL）评估社交-认知-情绪（SCE）表现，发现克罗诺杆菌丰度与情绪反应性（Emotionally Reactive）和情感问题（Affective Problems）评分显著正相关。随后用斑马鱼（Danio rerio）幼体模型，通过静态浸泡方式递送C. sakazakii ATCC 25944，观察到弯曲表型和运动不稳定性，表明CNS紊乱。通过转录组学（RNA-seq）和代谢组学（UPLC-Q-TOF-MS）分析揭示昼夜节律相关基因上调及脂质代谢失调。随机诱变（吖啶橙（AO）处理）结合全基因组测序（WGS）鉴定出脂多糖（LPS）生物合成和菌毛粘附相关基因的修饰子（modifier）变异减弱了神经毒性。纯化的LPS可重现CNS损伤表型，证实LPS的关键作用。结论：首次提供证据表明肠道克罗诺杆菌定植可能通过肠道来源的LPS信号影响人类情绪发展，强调其在肠脑轴（gut–brain axis）和神经行为健康中的被低估作用。

主要关键技术方法（不超过250字）：GUSTO队列（新加坡，前瞻性研究），16S rRNA基因V4区扩增测序，CBCL量表评估；斑马鱼（Danio rerio）幼体模型，静态浸泡感染；Illumina RNA-seq转录组分析；超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）非靶向代谢组学；吖啶橙（AO）随机诱变结合全基因组测序（WGS）鉴定变异；LPS提取（热酚水法）及定量（Pierce^?显色内毒素定量试剂盒）。

研究结果：

**Correlation between Cronobacter reads from human gut microbiota with SCE variables**：通过多元线性回归分析，调整性别、母亲和父亲种族后，发现24个月时克罗诺杆菌丰度与48个月时的情感问题（Affective Problems）评分（p=0.0013，q=0.0285）和情绪反应性（Emotionally Reactive）评分（p=0.0024，q=0.0285）显著正相关，且整体微生物α多样性（Pielou均匀度）和β多样性（Bray-Curtis相异度）均无显著关联，表明该关联具有特异性。

**Empirical findings of C. sakazakii colonizing in the digestive tracts of zebrafish larvae and inducing a distinct bending phenotype**：以8 log CFU/mL浓度浸泡感染3 dpf（days post-fertilization）斑马鱼幼体后，存活率>80%至72 hpi（hours post-infection），出现弯曲表型（标准化弯曲率：24 hpi为43%±7%，48 hpi为51%±3%），荧光显微镜显示GFP标记的C. sakazakii局限于胃肠道，无全身播散，表明肠道定植而非穿透屏障导致CNS干扰。

**Validation of the CNS disturbance in zebrafish larvae caused by enteric-colonized C. sakazakii by multi-omics approaches**：RNA-seq鉴定56个差异表达基因（DEGs），其中hint1上调最显著（log₂FC=5.69），RT-qPCR验证；GO富集分析显示上调DEGs富集于昼夜节律（circadian rhythm）调节和运动行为，下调DEGs富集于神经发育（neuroblast proliferation、forebrain generation of neurons）和结构维持（collagen fibril organization）；代谢组学显示三萜类（triterpenoids）、鞘脂类（sphingolipids）等脂质代谢物亚类上调，氨基酸和肽类（如L-焦谷氨酸、谷胱甘肽二硫化物）下调，提示神经退行性应激。

**Mechanistic speculations of the neurotoxicity induced by enteric-colonizing C. sakazakii**：通过吖啶橙（AO）随机诱变获得89个突变株，筛选出7个弯曲率降低≥50%的突变株（C8、C13、C35、C61、C64、C75、C83），其中C13的细菌载量与野生型无显著差异，但弯曲率降低；WGS分析显示C13、C8、C35突变株中修饰子（modifier）变异影响LPS生物合成相关蛋白（Kdo脂质IV(A)酰基转移酶、YejM）和菌毛粘附蛋白（inverse autotransporter beta domain-containing protein、fimbrial proteins）；LPS提取实验表明，野生型LPS诱导弯曲（39.9%±7.5% at 48 hpi），而C13和C35突变株LPS诱导的弯曲率显著降低（7.1%±7.5%和7.1%±1.3%），证实LPS结构变异影响神经毒性。

总结讨论部分：翻译研究结论。原文结论：C. sakazakii是一种食源性病原体，主要与新生儿坏死性小肠结肠炎、脑膜炎和败血症相关。作为一种机会性微生物，C. sakazakii也在健康个体中检测到。本研究证明，人类肠道中C. sakazakii的定植可能在不穿越肠道或血脑屏障的情况下导致对人类健康的慢性不良影响，特别是对中枢神经系统（CNS）和社交-认知-情绪（SCE）发育的影响。这些发现为肠道微生物群如何影响CNS进而影响认知发育提供了新的证据。