《Cancers》：Ferroptosis Biomarkers in HPV-Negative Head and Neck Squamous Cell Carcinoma
背景/目的：头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是一种侵袭性癌症，发生于口腔、咽、喉和上呼吸道。HNSCC根据是否存在高危型人乳头瘤病毒（HPV）感染分为不同的临床亚型。虽然HPV阳性HNSCC患者对常规和靶向治疗的反应优于HPV阴性患者，但HPV阴性病例的复发更频繁，且治疗选择有限。铁死亡（ferroptosis）是一种由过量脂质过氧化物积累引起的铁依赖性程序性细胞死亡形式。铁死亡生物标志物已被证明有助于在治疗耐药癌症模型中识别和触发铁死亡。识别和理解HPV阴性HNSCC中铁死亡生物标志物的功能，为更有效的治疗策略提供了可能性。方法：研究人员结合文献检索和公共在线铁死亡数据库FerrDB V3，客观识别和分类HPV阴性HNSCC中已建立和未建立的铁死亡生物标志物。基于这些生物标志物在HNSCC肿瘤发生中的已知作用，进一步识别了新的候选生物标志物。结果：共识别出30个与HPV阴性疾病相关的铁死亡生物标志物。这些生物标志物根据共同的生物学功能进行分组，并总结了每个标志物在HNSCC铁死亡中的预后和机制作用。结论：所描述的生物标志物为肿瘤分层以诱导铁死亡提供了手段，其中一些标志物为克服难治性HPV阴性疾病提供了潜在的新方法。这些生物标志物值得进一步研究，以设计未来选择性激活HPV阴性HNSCC中铁死亡的患者耐受性策略。
论文主体部分总结如下：
1. 引言
1.1 头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）
HNSCC是起源于上呼吸消化道鳞状上皮的恶性肿瘤，全球每年新发病例约90万，死亡约45万。主要风险因素包括烟草、酒精、槟榔、腌制鱼类、空气污染物和高危型HPV感染。根据HPV状态，HNSCC分为HPV阳性口咽癌和HPV阴性疾病，两者治疗指南不同。HPV阳性HNSCC由E7和E6病毒癌基因失活视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）和肿瘤蛋白53（TP53）引起；HPV阴性疾病主要由环境DNA损伤剂（如烟草相关致癌物）导致的突变积累引起，具有更高的突变负荷和拷贝数变异（CNVs）。标准治疗包括手术、化疗和放疗，HPV阳性患者预后更好。HPV阴性疾病治疗耐药性更强，复发更频繁。目前美国食品药品监督管理局（FDA）批准的靶向治疗仅有两类：西妥昔单抗（靶向表皮生长因子受体EGFR）和抗程序性死亡-1（PD-1）免疫检查点抑制剂（纳武利尤单抗和帕博利珠单抗），但应答不一，存在耐药问题。
1.2 铁死亡（Ferroptosis）
铁死亡是由游离铁引发的细胞死亡形式，对芬顿化学（Fenton chemistry）敏感。游离铁（Fe
2+）产生的活性氧（ROS）导致脂质过氧化和细胞死亡。多种癌症类型积累高水平的铁和ROS以维持加速生长。铁死亡区别于凋亡，具有三个标志：多不饱和膜磷脂的氧化、活性铁的可利用性、脂质过氧化物修复能力的丧失。肿瘤快速生长导致缺氧，产生过量ROS，迫使肿瘤发展抗氧化策略。在HNSCC中，放疗增加ROS产生，耐药细胞发展存活机制导致复发。多项研究表明铁死亡在多种癌症中起保护作用，诱导铁死亡可增强放疗效果。铁死亡还受表观遗传、转录和转录后修饰调控，并与免疫系统调节相关。线粒体在铁死亡中起重要作用，是ROS产生的主要场所。识别线粒体调控铁死亡的机制和相关通路生物标志物，为选择性增强肿瘤细胞铁死亡提供了新方法。
1.3 铁死亡生物标志物在HNSCC中的应用
癌症生物标志物是可客观测量的生物分子，用于识别肿瘤存在和状态。铁死亡生物标志物可用于识别和促进癌细胞对铁死亡的敏感性，或确定不同生物标志物如何影响癌症进展和耐药性。在肺癌、乳腺癌、肝细胞癌和肾细胞癌中，已评估了铁死亡易感性或耐药性生物标志物的治疗和预后价值。了解肿瘤生物标志物的作用机制对于制定个体化治疗至关重要。靶向耐药肿瘤选择性触发铁死亡是一个有吸引力的前提，因为这类细胞通常对凋亡程序耐药。小分子如erastin（抑制胱氨酸-谷氨酸转运体SLC7A11）和RSL3（抑制抗氧化酶GPX4）可在HNSCC中杀死耐药肿瘤细胞。本综述重点关注HPV阴性疾病中具有已知或潜在临床价值的生物标志物，因为HPV阳性HNSCC中谷胱甘肽（GSH）水平降低，使细胞更易受脂质过氧化和铁死亡影响；而HPV阴性肿瘤更缺氧，对低氧的代谢适应是细胞存活所必需的，这些因素导致了治疗难治性。
2. 方法学
选择HPV阴性HNSCC生物标志物
利用FerrDb V3数据库和文献检索，以无偏方式选择候选生物标志物。文献检索在Pubmed中进行，聚焦“铁死亡与HNSCC”，筛选出至少在2篇研究文章中描述的潜在生物标志物。单次引用的生物标志物根据与其他癌症的相关性进一步评估。此外，在HNSCC中具有已确立致癌作用且新发现铁死亡作用的生物标志物也被纳入。每个候选生物标志物在FerrDB V.3中进一步评估，确定其在铁死亡中的置信水平（Validated, Screened, Predicted, Deduced, GO）。排除仅属于Deduced和GO类别的生物标志物。此外，在FerrDB V3中独立搜索“Head and Neck”和“HNSCC”，按数据库分类为Driver, Suppressor, Marker或Unclassified。部分生物标志物在FerrDB中无匹配，但符合文献检索标准也被纳入。最终筛选出30个与HPV阴性HNSCC相关的生物标志物，按共同细胞功能或相同/相似分子通路分组。
3. HPV阴性HNSCC中的铁死亡生物标志物
3.1 铁调控
3.1.1 FTH1（铁蛋白重链）
FTH1是细胞内铁存储的主要成分，通过铁氧化酶活性防止氧化损伤。在HNSCC中过表达，与肿瘤进展和不良预后相关，是铁死亡的抑制因子。FTH1调控细胞增殖、血管生成、迁移、炎症、细胞外基质调节和淋巴结转移。FTH1过表达与吸烟和饮酒相关。NCOA4介导铁蛋白自噬降解，增加游离铁，促进铁死亡。IREB2沉默、MTF1抑制（通过ATM介导的磷酸化）以及BACH1转录抑制因子均可降低FTH1转录，促进铁死亡。TTC7B和PAR1通过JAK2/STAT3通路上调FTH1。FTH1过表达与免疫抑制性M2巨噬细胞浸润正相关。
3.1.2 TFR1（转铁蛋白受体1）
TFR1是负责细胞铁摄取的单次跨膜受体，通过网格蛋白介导的内吞作用内化转铁蛋白。TFR1将铁转运至线粒体，用于电子传递链中的铁硫簇生成。TFR1过表达或内吞循环增加导致铁过载，通过增强芬顿反应敏化细胞铁死亡。肿瘤细胞通过重编程铁代谢（增加铁储存、增强抗氧化通路或改变脂质代谢）来抵抗。在HNSCC中，TFR1过表达与预后不良相关，复发患者TFR1水平升高。突变的HRAS和KRAS诱导TFR1内体循环，增加铁水平，但也可增强铁死亡敏感性。TFR1是抗肿瘤治疗的潜在靶点，但抑制TFR1可能导致贫血和T细胞凋亡。
3.1.3 ATG5（自噬相关5）
ATG5是E3泛素连接酶和关键自噬调控因子，通过铁蛋白自噬降解造成铁过载，导致铁死亡。在HPV阴性鼻咽癌中，ATG5表达与铁死亡敏感性增加相关，但高ATG5表达促进HNSCC细胞增殖，与总生存期缩短和不良预后相关。ATG5可能与线粒体核糖体蛋白L（MRPL）家族成员表达相关，也是HNSCC中的免疫浸润标志物，与PD-L1/PD-L2信号正相关，与CD8
+ T细胞减少相关，因此高ATG5患者可能对免疫检查点抑制剂（ICI）治疗反应不佳。
3.1.4 NCOA4（核受体共激活因子4）
NCOA4结合FTH1，介导铁蛋白自噬降解，释放游离铁，激活铁死亡。在HNSCC中，NCOA4上调增加ROS产生，降低FTH1水平。高NCOA4表达是预后改善和细胞增殖减少的标志。低NCOA4被鉴定为HPV阴性HNSCC患者和细胞系中放射抗性的基因签名组分。NCOA4下调部分由致癌微小RNA miR-182-5p过表达介导，导致铁死亡抑制。
3.1.5 PCBP1（多聚胞嘧啶结合蛋白1）
PCBP1是RNA结合蛋白，也作为铁伴侣，将铁递送至铁蛋白和其他铁结合蛋白。PCBP1与BolA2协同防止氧化损伤，促进铁硫簇形成。在癌症中，PCBP1作为肿瘤抑制因子。在HPV阴性HNSCC细胞和异种移植中，PCBP1通过结合铁死亡诱导基因BECN1和ALOX15的3'-UTR区域，抑制其翻译，从而阻止铁蛋白自噬介导的铁死亡。siRNA敲低PCBP1或使用抗炎药柳氮磺吡啶可逆转该抑制作用，提示了铁死亡再敏化的潜在新方法。
3.2 反向转运体
3.2.1 SLC7A11（xCT）
SLC7A11是胱氨酸-谷氨酸反向转运体的轻链亚基，负责细胞外胱氨酸摄取，用于谷胱甘肽（GSH）合成，保护细胞免受氧化应激。SLC7A11是铁死亡的关键抑制因子，其表达在癌症中常升高。SLC7A11转录受NRF2和ATF4调控，与TP53、SOCS1、BAP1、CD44、SLC3A2、ARID1A和PRC1等蛋白相互作用。在HNSCC中，SLC7A11过表达与淋巴结转移和总生存期缩短相关。SLC7A11在缺氧条件下维持氧化还原稳态，NRF2上调导致铁死亡抵抗和放射抗性。HPV阴性患者中SLC7A11水平通常高于HPV阳性患者。SLC7A11可被IL-6通过JAK/STAT3通路转录激活，促进铁死亡抵抗。多种药物如erastin、柳氮磺吡啶等可抑制SLC7A11，触发铁死亡。
3.2.2 SLC7A5（LAT1）
SLC7A5是中性必需氨基酸转运体，负责转运八种必需氨基酸中的大部分，对mTOR活性至关重要。在癌症中常过表达，与HNSCC、乳腺癌和胃癌的肿瘤分期和不良预后相关。SLC7A5过表达通过维持动态氨基酸稳态防止氧化应激，赋予铁死亡抵抗。SLC7A5表达与SLC7A11表达正相关，且与TP63共同增强铁死亡抵抗。SLC7A5可低亲和力结合erastin，辅助铁死亡诱导。SLC7A5上调还导致免疫治疗抵抗增加，TP63
+/SLC7A5
+患者肿瘤微环境（TME）中免疫抑制性细胞浸润增加。
3.3 氧化还原调控
3.3.1 GPX4（谷胱甘肽过氧化物酶4）
GPX4通过将脂质ROS转化为脂质醇维持氧化还原稳态，是GSH介导抗氧化防御的下游调控因子。GPX4缺失导致ROS积累和膜脂氧化，引发铁死亡。GPX4在HNSCC、三阴性乳腺癌、胃癌和食管癌中常升高，导致铁死亡抵抗和放疗抵抗，预后不良。低GPX4水平的HNSCC肿瘤与高免疫检查点基因表达、铁死亡增加和生存改善相关。某些癌症通过谷氨酰胺分解下调GPX4，当半胱氨酸水平降低时，可导致铁死亡诱导。
3.3.2 CISD1（mitoNEET）
CISD1含有氧化还原活性的[2Fe-2S]簇，作为线粒体的氧化还原和pH传感器。过表达保护组织免受铁死亡。CISD1在调控线粒体氧化还原稳态和生物能量学中发挥作用，敲低或敲除增加ROS产生并减少细胞增殖。CISD1通过限制铁摄取和线粒体铁积累抑制铁死亡。在HNSCC中，高CISD1表达与预后不良和免疫逃逸增加相关，并与淋巴结转移和基因扩增事件相关。抗CISD1策略与ICI联合可提高应答。
3.4 转录调控
3.4.1 TP53
TP53是肿瘤抑制基因，在HNSCC中是最常突变的基因（39-67%）。TP53突变导致功能丧失，与不良预后相关。TP53上调可通过抑制SLC7A11或GPX4表达，或促进MDM2等抗铁死亡基因，赋予铁死亡抵抗。HPV阴性且TP53突变的患者多种铁死亡基因失调，阻止铁死亡，导致更差预后。TP53还可通过ALOX12介导的SLC7A11下调、抑制SLC7A11、或通过SAT1和GLS2调控脂质过氧化来诱导铁死亡。
3.4.2 ATF4
ATF4在氨基酸匮乏、病毒感染或内质网（ER）应激时激活，转录SLC7A11，抑制ROS产生，保护细胞免受铁死亡。在HNSCC中，ATF4与GCN2协同驱动肿瘤细胞增殖、稳态和存活。新型抑制剂AST-0513可抑制该通路，导致细胞周期阻滞和凋亡，提供潜在治疗选择。
3.4.3 NFE2L2（NRF2）
NFE2L2编码NRF2，是抗氧化反应的主调控因子。在稳态下，NRF2与KEAP1结合并被泛素化降解。氧化应激时，KEAP1与p62结合，NRF2转位至细胞核，转录FTH1、SLC7A11、GPX4等铁死亡基因，赋予铁死亡抵抗。在HNSCC中，NRF2通路的过度激活与放射抵抗相关。青蒿琥酯可在HNSCC细胞中诱导铁死亡，NRF2下调可增强该效应。
3.4.4 TP63
TP63是与TP53相关的转录因子，调控染色质、凋亡和细胞周期。ΔNp63亚型在鳞状上皮基底层表达，驱动角质形成细胞分化。TP63在HNSCC中过表达，与增殖、存活和不良预后相关，但也可能发挥肿瘤抑制作用。在HPV阴性细胞中，TP63过表达抑制铁死亡，通过上调SLC7A5实现。TP63还上调GPX4和ALDH3A1以逃避铁死亡。
3.5 细胞代谢
3.5.1 AKR1C3
AKR1C3属于醛酮还原酶家族，催化醛酮还原为醇。在肝细胞癌中，AKR1C3通过上调YAP核转位增加SLC7A11，或与HSPA5结合稳定GPX4和GSH产生，抑制铁死亡。在HNSCC中，AKR1C3过表达与总生存期降低相关，并导致放射抵抗。选择性抑制AKR1C3可增强顺铂的杀伤效果。
3.5.2 PRKAA2（AMPKα2）
PRKAA2是AMPK的催化亚基，作为能量传感器。低ATP时被LKB1磷酸化，刺激ATP产生，抑制mTOR活性。在HNSCC中，PRKAA2表达上调，通过刺激SLC7A11和GPX4活性抑制凋亡和铁死亡。PRKAA2活性对抗西妥昔单抗的代谢抑制效应，提示联合抗铁死亡药物可能克服西妥昔单抗耐药。
3.6 生长因子信号
3.6.1 EGFR
EGFR在约30%的HNSCC中上调，与不良预后、增殖、放疗抵抗相关。在鼻咽癌中，EGFR结合并稳定SLC7A11，抑制MHC-I呈递，促进免疫逃逸。西妥昔单抗联合GPX4抑制剂RSL3可增强铁死亡。阻断EGFR配体epiregulin也可诱导铁死亡。
3.6.2 KRAS
KRAS是RAS小GTP酶家族成员，在HNSCC中激活与肿瘤发展和不良预后相关。KRAS通过脂质生物合成和抗氧化反应调控铁死亡抵抗。在HNSCC中，KRAS是驱动铁死亡的中枢基因，高KRAS水平与CD8
+和CD4
+ T细胞浸润增加及M1巨噬细胞极化相关。
3.6.3 HRAS
HRAS在HNSCC中常失调，高达6%的患者表达增加，3-4%有突变激活。HRAS通过调控GPX4活性驱动铁死亡，高HRAS与免疫微环境改变相关，包括巨噬细胞浸润增加、T细胞增多和PD-L1高表达。
3.6.4 PTEN
PTEN是磷酸酶，将PIP3去磷酸化为PIP2，抑制PI3K/AKT/mTOR信号。约30%的HNSCC中PTEN功能丧失，导致肿瘤生长、凋亡抵抗和总生存期缩短。PTEN被鉴定为负调控铁死亡的中枢基因，PTEN缺失增加铁死亡抵抗。低PTEN表达与免疫抑制微环境相关。
3.6.5 AURKA
AURKA是丝氨酸/苏氨酸激酶，确保纺锤体组装。在许多癌症中表达和活性增加，导致非整倍体。在HNSCC中，AURKA与肿瘤风险、侵袭、不良预后和顺铂耐药相关。高AURKA表达赋予铁死亡抵抗，是TP53突变HPV阴性患者的铁死亡预后基因签名组成部分。AURKA敲低诱导铁死亡，其抑制剂alisertib可抑制NRF2和GPX4通路。
3.6.6 FAT1
FAT1是原钙黏蛋白家族成员，参与细胞间粘附。FAT1在HNSCC中频繁突变（23-29%），功能缺失导致总生存期缩短、淋巴结转移和复发增加。高FAT1表达增加顺铂耐药和GSH水平，保护免受ROS和铁死亡。通过靶向LRP受体和下游Wnt信号可降低GSS活性，再敏化铁死亡。FAT1突变细胞中谷氨酰胺代谢失调可敏化铁死亡。
3.6.7 PAR1
PAR1是G蛋白偶联受体，调控凝血酶信号。在HNSCC中，PAR1通过JAK2/STAT3通路驱动增殖、存活、迁移、侵袭和EMT。PAR1过表达调控SLC7A11、GPX4和FTH1表达。PAR1抑制剂vorapaxar可增强erastin介导的铁死亡，提供联合抗铁死亡靶点。
3.7 免疫信号
3.7.1 IFNG（IFNγ）
IFNG是参与肿瘤免疫应答的细胞因子，导致线粒体膜电位丧失、ROS增加、JAK/STAT1通路激活和凋亡。IFNG诱导的HNSCC凋亡包括铁死亡特征。IFNG通过STAT1通路抑制SLC7A11，促进肿瘤细胞铁死亡。在肾上腺皮质癌中，IFNG增强erastin诱导的铁死亡。在HNSCC中，IFNG激活与更好的免疫治疗反应相关。
3.7.2 SOCS1
SOCS1是细胞因子信号负调控因子，通过反馈环衰减JAK/STAT信号。SOCS1作为肿瘤抑制因子，通过激活TP53下调SLC7A11表达，促进铁死亡。高SOCS1表达与HNSCC预后改善相关，并对应巨噬细胞和B细胞浸润增加，有利于促炎T细胞浸润。
3.7.3 TNFSF9
TNFSF9是共刺激配体，结合TNFRSF9（CD137）驱动抗肿瘤免疫。在HNSCC中，TNFSF9表达在高风险组中升高，作为免疫铁死亡预后签名的一部分。高风险患者具有免疫抑制性细胞因子和免疫检查点参与，与肿瘤抑制性TME和ICI应答抑制相关。高TNFSF9患者预测对ICI治疗反应更好。
3.8 内吞调控
3.8.1 CAV1（小窝蛋白1）
CAV1是整合膜蛋白，诱导质膜内陷形成小窝，介导非受体介导的内吞。CAV1在HNSCC中过表达，导致顺铂、放疗和西妥昔单抗耐药。siRNA沉默CAV1增强铁死亡敏感性。有趣的是，CAV1低表达与区域淋巴结受累增加相关，可能为通过铁死亡诱导治疗晚期疾病提供机会。
3.8.2 CTTN（皮层肌动蛋白结合蛋白）
CTTN是F-肌动蛋白结合蛋白，稳定Arp2/3生成的肌动蛋白分支点。CTTN基因位于11q13区域，在25-50%的HNSCC中扩增，与肿瘤分级、淋巴结转移、复发和总生存期缩短相关。CTTN调控外泌体分泌和侵袭。网络分析表明CTTN是铁死亡抑制因子，可能通过TFR1介导的转铁蛋白铁摄取参与铁死亡抵抗。
3.9 支架蛋白
3.9.1 TTC7B（四肽重复结构域7B）
TTC7B是支架蛋白，与PI4KA和FAM126A形成复合物，定位PI4KA至质膜。在HNSCC中，TTC7B升高与口腔和喉癌患者总生存期缩短相关，且在HPV阴性中更常见。TTC7B与ATG5、FTH1、NCOA4等铁死亡基因表达相关，可能通过PINCH-ILK-PARVIN复合物促进侵袭和转移，并与免疫抑制性细胞浸润相关。
3.9.2 TRIB3（Tribbles假激酶3）
TRIB3是假激酶，调控MAPK和PI3K信号。在HNSCC中，TRIB3过表达通过JNK/JUN通路驱动有氧糖酵解，促进增殖、迁移和肿瘤生长。TRIB3还能抑制铁死亡，通过与TCF4和β-catenin形成复合物，阻断ALOXE3转录，减少多不饱和脂肪酸氧化。TRIB3抑制剂hesperidin可增强HPV阴性细胞系和异种移植中的铁死亡。
3.10 翻译后修饰
SENP1（SUMO特异性蛋白酶1）
SENP1逆转SUMO化修饰，在多种癌症中过表达，作为癌基因。在HNSCC中，SENP1升高与预后不良相关，与铁死亡基因表达增加相关。SENP1敲低通过ACSL4调控脂质过氧化增强铁死亡，并降低SLC7A11和GPX4表达。天然和合成SENP1抑制剂是抗癌研究热点，可能用于未来诱导HNSCC铁死亡。
4. 结论
本文识别和描述了30个来自FerrDB V3数据库和文献验证的HPV阴性HNSCC中铁死亡抵抗或敏感的生物标志物。这些标志物为患者分层和改善治疗结局提供了潜在手段。但存在局限性，包括诱导铁死亡可能对健康细胞造成氧化损伤、心脏毒性、肿瘤异质性、HPV筛查方法不一致、以及临床前模型与临床结果整合的挑战。未来需利用患者血浆和血清谱验证这些标志物在个体化医疗中的应用。
