真核和细菌肠道群落沿生活方式相关的城市化梯度变化：德国和马达加斯加的比较分析

《Gut Microbes》：Eukaryotic and bacterial gut communities vary along a lifestyle-associated urbanization gradient: comparative analysis of Germany and Madagascar

　　

肠道真核生物（intestinal eukaryotes）在肠道微生物组研究中常被忽视，但它们在人类健康中发挥关键作用，并导致影响全球数百万人的危及生命的疾病。这种忽视还源于来自肠道（寄生性）真核生物高流行地区样本的代表性不足。因此，对肠道真核生物在广泛生活方式和社会经济差异中如何变化的整体理解仍然有限。鉴于全球城市化和工业化的兴起及其对生活方式、病原体暴露和环境因素的深远影响，解决这一差距变得越来越紧迫。研究人员（研究人员）对来自马达加斯加（Andina、Ankazomborona、Tsiroanomandidy）和德国（Kiel）的1387份粪便样本中的真核和细菌微生物群（microbiota）的多样性和组成进行了表征，这些样本涵盖了与城市化相关生活方式的复合梯度。通过并行使用18S V4–V5 rRNA和16S V3–V4 rRNA扩增子基因测序，研究人员确定了真核和细菌群落组成的独特区域模式。马达加斯加队列显示出更高的蠕虫（例如Schistosoma、Necator）和原生动物（例如Entamoeba、Dientamoeba）流行率。值得注意的是，与食物相关的真菌（food-associated fungi）的多样性沿着复合城市化相关生活方式梯度增加，在德国样本中达到峰值。细菌16S扩增子测序确认并扩展了已知的地理差异，显示德国以Bacteroides为主，而马达加斯加以Prevotella和Firmicutes为主。这项工作强调了在微生物组研究中整合真核和原核数据以及考虑不同生活方式相关因素的重要性。研究人员进一步强调需要更深入地研究饮食和环境真菌在人类肠道生态系统中的作用。

**研究背景与意义**
肠道微生物组包括细菌、古菌、病毒和真核生物，其中真核生物（如原生动物、真菌和蠕虫）在人类健康中扮演复杂角色，既可引起疾病（如土源性蠕虫感染影响全球24%人口，真菌感染威胁超3亿人），也可能具有保护作用（如蠕虫减轻过敏、Blastocystis与有益代谢相关）。然而，肠道真核生物在微生物组研究中长期被忽视，主要由于高通量测序方法实施困难、真核数据库不完善，以及来自高流行地区样本的缺乏。城市化与工业化进程深刻改变生活方式、饮食、病原体暴露和卫生条件，但尚不清楚肠道真核群落如何随城市化相关生活方式梯度变化。现有研究多聚焦细菌，对真核生物及其与细菌互作的认识极为有限。为填补这一空白，研究人员在《Gut Microbes》上发表论文，系统比较了德国（高度城市化工业化）和马达加斯加（不同城市化程度，总体低工业化）人群的肠道真核与细菌群落，揭示了沿复合城市化相关生活方式梯度的微生物组差异，强调了整合真核原核数据及考虑生活方式因素的重要性。

**主要关键技术方法**
研究基于1387份粪便样本，来自马达加斯加三个地点（Andina、Ankazomborona、Tsiroanomandidy）和德国Kiel，样本分别于2020年（马达加斯加）和更早时期（德国）收集，均采用无保存液家庭采集、冷冻运输。DNA提取使用相同标准化方案，但批次分开处理。采用18S rRNA基因扩增子测序（V4-V5区，引物616*F/1132R）和16S rRNA基因扩增子测序（V3-V4区），分别通过DADA2流程处理得到扩增子序列变体（ASV）。真核ASV以PR2数据库注释，细菌ASV以RDP数据库注释，并采用decontam进行基于流行率的去污染。多样性分析使用Shannon指数，β多样性通过NMDS和PERMANOVA评估，原核-真核共现分析采用Procrustes、Mantel检验及距离相关分析（基于5000次置换）。此外，对Saccharomyces cerevisiae进行物种特异性qPCR正交验证。

**研究结果**
**1. 德国真核多样性升高与真菌多样性升高相关**
通过Shannon指数分析，真核α多样性在安卡佐姆博罗纳（Ankazomborona）和基尔（Kiel）最高，安迪纳（Andina）最低。真菌多样性在Kiel显著高于所有马达加斯加地点，而蠕虫/原生动物多样性则相反，在Kiel最低。多元线性回归校正年龄、性别、测序深度后，部分差异减弱，但安卡佐姆博罗纳的真核多样性仍显著低于安迪纳。PERMANOVA显示地点解释了真核群落组成最大变异（R²=0.028），NMDS显示良好的分离。

**2. 德国食物相关真菌读段流行率最高**
食物相关真菌（如Saccharomyces、Candida、Galactomyces、Pichia、Debaryomyces）在Kiel样本中流行率最高（92.23%），安卡佐姆博罗纳最低（65.12%）。Saccharomyces在Kiel占43.16%，安迪纳仅8.28%。qPCR证实Kiel的S. cerevisiae浓度是安卡佐姆博罗纳的5.2倍。Candida在Kiel成为核心属（74.26%），而马达加斯加地点较低。

**3. 马达加斯加原生动物和蠕虫的地点特异性丰度模式**
在26个高丰度真核属中，21个存在显著地点差异。蠕虫如Schistosoma在三个马达加斯加地点流行率均>13%，Kiel仅4.29%。原生动物Blastocystis在所有地点均为核心属（Kiel 62.47%至安卡佐姆博罗纳83.26%），而Entamoeba在安卡佐姆博罗纳成为核心属（59.07%）。Dientamoeba在安迪纳最丰富，Necator在安卡佐姆博罗纳最丰富。真菌Malassezia、Cryptococcus等在安迪纳和Tsiroanomandidy较高。

**4. 细菌组成因地点而异且与真核群落共变**
细菌α多样性在安卡佐姆博罗纳最高，显著高于其他地点。β多样性分析显示地点解释最大变异（R²=0.125）。Blastocystis与细菌群落组成关联最强（R²=0.00396）。37个细菌属丰度存在显著地点差异：Bacteroides、Alistipes等在Kiel富集；Prevotella、Treponema等在安卡佐姆博罗纳富集；Clostridium_sensu_stricto、Lactobacillus等在安迪纳富集。共有27个细菌核心属，真核仅有Blastocystis为共享核心。

**5. 原核和真核关联具有强烈区域性**
共现网络分析显示，Blastocystis和Entamoeba在不同地点成为关键节点，但网络结构差异显著。在安迪纳，网络密集，涉及Blastocystis与多种细菌（如Ruminococcus、Oscillibacter）的正负关联。在安卡佐姆博罗纳，Blastocystis呈现更多负关联。在Tsiroanomandidy和Kiel，真菌-细菌共现更突出，如Candida、Debaryomyces等。一致性共现模式（如Blastocystis与Firmicutes成员）跨地点存在，但Entamoeba相关共现仅见于马达加斯加。

**讨论与结论**
讨论部分总结了三大发现：1）食物相关真菌在更城市化地区的丰度升高，可能与饮食转向加工食品有关，提示真菌变化可作为饮食变迁和疾病风险的早期生物标志物；2）马达加斯加内部存在复杂区域模式，超越简单城乡分类，环境因素（如气候、文化）比城市化程度对微生物组影响更强；3）细菌-真核互作模式随城市化相关生活方式改变，从原生动物主导转向真菌主导，可能影响肠道生态系统动态和炎症疾病风险。研究局限性包括：城市化与工业化无法分离、缺乏个体层面饮食/用药元数据、季节差异、仅一个高度工业化地点、真核参考数据库不完整等。研究结论（翻译）：总体而言，本研究强调了推进微生物组研究和全球健康监测的两个关键需求：第一，将真核生物纳入微生物组研究，以理解驱动健康和疾病转变的跨界相互作用；第二，传染病监测必须考虑超越“简单”城乡分类的地理模式，揭示宿主、环境和微生物组之间复杂的流行病学景观和相互作用模式。许多鉴定出的真菌属于世界卫生组织真菌优先病原体清单（FPPL），但其生态模式仍不清楚，且可能缺乏对区域差异的考虑。