《Cancers》：RNA and Mitochondrial Reprogramming Associated with Azacytidine Treatment in Higher-Risk Myelodysplastic Syndromes: A Pilot Study
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目的：阿扎胞苷（azacytidine, AZA）用于治疗高风险骨髓增生异常综合征（higher-risk myelodysplastic syndromes, HR-MDS）对表观基因组产生显著影响，主要通过DNA去甲基化及表观遗传沉默基因再激活实现。除已确
目的：阿扎胞苷（azacytidine, AZA）用于治疗高风险骨髓增生异常综合征（higher-risk myelodysplastic syndromes, HR-MDS）对表观基因组产生显著影响，主要通过DNA去甲基化及表观遗传沉默基因再激活实现。除已确立机制外，与AZA相关的分子效应日益受到关注。材料与方法：采用液相色谱-串联质谱（liquid chromatography combined with mass spectrometry, LC-MS/MS）技术准确评估HR-MDS队列（N = 8）AZA治疗前后的多种RNA与DNA修饰。通过microRNA下一代测序（miRNA-next generation sequencing, NGS）绘制AZA治疗反应性调控通路图谱，随后采用多层生物信息学流程整合miRNA差异表达、基因集富集及网络分析。采用数字PCR（digital PCR, dPCR）检测AZA治疗前后线粒体（mt）DNA拷贝数精确变化。结果：AZA治疗前后miRNA差异表达模式所影响的细胞通路可区分治疗应答者（Responders）与非应答者（Non-Responders）的临床表型。研究人员评估了细胞内RNA修饰：N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine, m6A）、5-甲基胞苷（5-methylcytidine, m5C）、N1-甲基腺苷（N1-methyladenosine, m1A）、2′-O-甲基鸟苷（2′-O-methylguanosine, Gm）及腺苷至肌苷（adenosine-to-inosine, A → I）编辑对其治疗反应的潜在影响。核DNA/线粒体DNA（mtDNA）甲基化谱及mtDNA拷贝数减少体现了AZA影响的线粒体特征。结果表明，AZA治疗的HR-MDS应答者中，新生造血干祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cells, HSPCs）通过正常化糖酵解代谢及增强核糖体活性进行适应。观察到的mtDNA含量减少可与生存改善及恶性进展抑制相关联。非应答者尽管经历mtDNA耗竭，似乎无法协调此类代谢重编程，仍处于AZA治疗劣势。
该研究背景立足于高风险骨髓增生异常综合征（HR-MDS）的临床治疗现状。阿扎胞苷（AZA）作为标准一线治疗药物，虽能通过DNA去甲基化发挥作用，但存在应答持久性有限及治疗耐药性高发的问题。目前AZA应答与耐药的分子决定因素尚不完全明确且难以预测，除DNA甲基化外，RNA修饰、miRNA调控及线粒体生物学在AZA治疗中的作用日益受到关注，但缺乏整合性的多层表观遗传研究。为此，研究人员开展了一项针对8例匹配HR-MDS患者AZA治疗前后样本的试点研究，旨在揭示AZA诱导的核与线粒体调控层协调重编程假说，甄别治疗应答的生物标志物。研究得出结论：AZA应答者表现出特定的miRNA偏移、Gm RNA修饰减少及mtDNA拷贝数显著回归，并通过正常化糖酵解与增强核糖体活性实现代谢重编程，而非应答者无法协调此过程。该研究发表于《Cancers》，其意义在于揭示了超越DNA去甲基化的新型分子靶点与许可性分子机制，为理解AZA疗效提供了整合表观遗传与线粒体的新视角。
为开展研究，研究人员招募了希腊里翁帕特拉斯大学医院血液科确诊的化疗初治HR-MDS患者（N=8，排除慢性粒单核细胞白血病及继发性病例），所有患者接受标准AZA方案（75 mg/m2 × 7天，28天周期）并完成6个周期，收集治疗前后配对骨髓标本分离骨髓单个核细胞（BMMCs）。关键技术方法包括：采用miRNA下一代测序（NGS）结合DESeq2差异表达分析及基因集富集分析（GSEA）解析miRNA网络；利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定量检测总RNA中m6A、m5C、m1A、Gm及A→I编辑等修饰水平；通过LC-MS/MS评估核DNA（nDNA）与mtDNA的5′甲基-2′脱氧胞苷（5mdC）甲基化水平；运用数字PCR（dPCR）靶向MT-CYB与GAPDH绝对定量mtDNA拷贝数（mtCN），并采用非参数统计进行组间比较。
3.1. Differential Modulation of miRNA Networks Discriminates AZA Responder Against Non-Responder HR-MDS Patients
研究人员对AZA治疗6个周期前后的HR-MDS患者骨髓样本进行miRNA NGS测序，将患者分层为应答者（n=3）与非应答者（n=4）。单个miRNA差异表达分析未达显著阈值，遂采用GSEA捕获协调变化。结果发现两大调控模块：其一为应答者中相对非应答者下调的miRNA（负交互系数），暗示其靶通路去抑制，显著富集糖酵解（Glycolysis）、丙酮酸代谢（Pyruvate metabolism）、胞质小核糖体亚基及核糖体蛋白等合成代谢通路；其二为应答者中维持或上调的miRNA（正交互系数），富集饥饿反应（response_to_starvation）与细胞应激反应靶基因如KCNB1、FBXL5等，表明应答者通过miRNA介导抑制应激信号。整合网络分析显示这些miRNA节点与生物学主题构成特异性调控架构，区分两组患者。
3.2. AZA Treatment-Associated Mild Shifts of Global m5C, m6A, m1A, Gm, and Inosine RNA Modifications
研究人员通过LC-MS/MS分析HR-MDS队列治疗前后总RNA的五种修饰。非应答者显示m5C、m6A、m1A轻度下降，应答者则表现不一致，但应答者Gm呈明确下降趋势（p=0.114），非应答者Gm则增加，A→I编辑水平几乎不受影响。排除两例技术离群值后，尽管受样本量限制未达统计学显著，但Gm减少趋势在应答者中显现，提示其作为潜在表观转录组生物标志物的价值，其他修饰的轻微改变可能参与抑制恶性翻译程序。
3.3. Global Nuclear DNA Methylation Levels Are Reduced Post-AZA Treatment
研究人员利用LC-MS/MS评估nDNA与mtDNA的5mdC水平。mtDNA在所有比较中无显著变化，稳定在0.2（5mdC/102dG）。nDNA在AZA治疗后信号强度下降，非应答者从0.23降至0.19，应答者从0.19降至0.17，但统计上无显著差异（非应答者p=0.11，应答者p=0.69），表明在本研究方法敏感度内AZA未引起测量到的5mdC显著改变。
3.4. AZA Therapy Induces mtDNA Copy Number Regression
研究人员通过dPCR绝对定量mtCN。整个队列mtDNA拷贝数中值从治疗前342.7降至治疗后246.1（p=0.023），8例中7例下降（中值降幅28.8%），仅1例非应答者微增。应答者与非应答者间Δ值无显著差异（p=0.686），表明mtDNA拷贝数回归是AZA治疗的普遍特征，而非区分应答的标志，但其在应答者中与代谢重塑协同相关。
讨论部分指出，AZA除DNA去甲基化外具多重机制，本研究确认全局核DNA去甲基化特征，并谨慎提出基于小样本但高精度的多层表观遗传结果。Gm RNA修饰在应答者中减少，结合Gm在初级miRNA转录本及非编码RNA互作中的功能，暗示其参与表观调控。miRNA网络重建显示应答者恢复前列腺素合成调节、糖酵解觉醒及核糖体功能，抑制饥饿应激反应，利于HSPC分化与表观重编程，代谢转变影响乙酰辅酶A、S-腺苷甲硫氨酸等辅因子进而调节表观酶。mtDNA拷贝数减少与OXPHOS部分脱依赖及生存改善相关，非应答者虽mtDNA耗竭却无法协调代谢转换。结论部分总结：本研究限于少量HR-MDS患者，AZA效应凸显应答者Gm RNA修饰减少及特定miRNA家族正向调控，潜在恢复前列腺素合成调节、核糖体蛋白合成与功能及糖酵解等通路；饥饿反应受抑赋予临床表型独特获益；线粒体生物发生层面AZA显著减少mtDNA拷贝数，此AZA特征需进一步解码其临床角色。
