不同物种细胞系对猪δ冠状病毒的易感性

《Viruses》：Susceptibility of Cell Lines from Different Species to Porcine Deltacoronavirus

　　

猪δ冠状病毒（PDCoV）是一种新兴的猪肠道冠状病毒，可引起仔猪严重腹泻，导致全球养猪业遭受重大经济损失。先前研究报道，PDCoV可实验性感染多种动物物种。然而，PDCoV在非自然宿主细胞系中的复制能力仍 largely unknown。在此，研究人员研究了外源胰蛋白酶对PDCoV复制的影响，并系统评估了来源于人、鼠和猫的多种细胞系对PDCoV的易感性。结果表明，高度易感细胞系（H1299、Caco-2、MC-38）在无需外源胰蛋白酶的情况下即可支持高效病毒复制，而高浓度胰蛋白酶在感染的H1299、U251和Neuro-2a细胞中诱导了显著的合胞体形成。此外，本研究还发现，在半易感细胞系中，胰蛋白酶以浓度依赖性方式增强PDCoV复制。PDCoV可在多种人、鼠和猫来源的细胞系中复制。人细胞（H1299、Caco-2）和小鼠MC-38对PDCoV感染高度易感，而MCF-7、TE-10和KYSE-410细胞则完全不支持。结果还揭示了基础APN表达与细胞对PDCoV易感性之间的潜在相关性。总之，本研究为评估PDCoV的跨种传播和人畜共患风险提供了基础。

**论文解读：猪δ冠状病毒在不同物种细胞系中的易感性及其胰蛋白酶调控机制**

**研究背景与目的**
猪δ冠状病毒（Porcine deltacoronavirus，PDCoV）是一种属于冠状病毒科δ冠状病毒属的新兴猪肠道冠状病毒，主要感染一周龄以内的仔猪，引发严重腹泻与脱水，对全球养猪业造成巨大经济损失。该病毒于2012年在香港首次通过分子监测发现，随后在2014年于美国暴发，并在中国、韩国、日本、泰国等多个养猪国家被检出。除猪外，PDCoV还可实验性感染野鸟、雪貂、鸡、火鸡、犊牛及小鼠等多种脊椎动物。更关键的是，有研究在急性发热患儿的血浆中检测到PDCoV核酸，提示其具有跨物种传播至人类的潜在风险。然而，PDCoV在非自然宿主细胞系中的复制能力尚不明确，尤其缺乏针对人、鼠、猫等物种来源细胞系的系统评估。因此，本研究旨在探讨外源胰蛋白酶对PDCoV复制的影响，并系统评价多种细胞系对PDCoV的易感性，以评估其跨种传播风险及人畜共患潜力。该论文发表于《Viruses》期刊。

**主要关键技术方法**
研究人员采用的主要关键技术包括：免疫荧光法（IFA）检测病毒核衣壳蛋白（NP）表达；Western blotting分析蛋白积累动态；定量实时逆转录PCR（RT-qPCR）测定病毒RNA载量及宿主氨肽酶N（APN）mRNA相对表达水平（以β-actin为内参）；半数组织培养感染剂量（TCID₅₀）实验测定病毒滴度；系统发育分析（邻接法，1000次bootstrap重复）基于GenBank中22个代表性脊椎动物APN基因序列构建进化树。所有细胞系（包括人源的H1299、H460、HepG2、U251、MCF-7、TE-10、KYSE-30、KYSE-410、Caco-2，鼠源的CT26.WT、MC-38、Neuro-2a，猫源的CRFK、F81）均培养于含10%胎牛血清的DMEM中，病毒株为PDCoV CH/JXJGS01/2016，在LLC-PK1细胞中扩增。

**研究结果**
**3.1 胰蛋白酶对不同宿主来源细胞系中PDCoV复制的影响**
通过IFA分析14种细胞系在梯度胰蛋白酶浓度（0–10 μg/mL）下的PDCoV感染情况，发现胰蛋白酶对病毒复制具有细胞类型特异性调节作用。高度易感细胞系（H1299、Caco-2、MC-38）在无外源胰蛋白酶时即可支持高效复制，且随着胰蛋白酶浓度增加，荧光强度无明显变化；但高浓度胰蛋白酶（2.5–10 μg/mL）在感染的H1299、U251和Neuro-2a细胞中诱导了显著的合胞体形成。在半易感细胞系（H460、U251、Neuro-2a）中，胰蛋白酶以浓度依赖性方式增强PDCoV复制。HepG2、KYSE-30、CT26.WT、CRFK、F81细胞也支持PDCoV复制，且胰蛋白酶可提高病毒产量。MCF-7、TE-10、KYSE-410细胞在所有胰蛋白酶浓度下均未检测到荧光信号，呈完全非易感表型。

**3.2 人肺和结直肠细胞对PDCoV感染高度易感**
以0.1 MOI感染H460、H1299、Caco-2细胞，在0、6、12、18、24 hpi收集样品。IFA和Western blotting显示，NP蛋白在12 hpi开始出现，并随时间增强。RT-qPCR和TCID₅₀检测表明，病毒RNA载量和感染性滴度均呈指数增长，24 hpi达到峰值，证实PDCoV在这三种细胞中高效复制。

**3.3 不同器官来源的人细胞对PDCoV易感性存在异质性**
对肝细胞（HepG2）、神经细胞（U251）、乳腺细胞（MCF-7）、食管细胞（TE-10、KYSE-30、KYSE-410）进行类似分析。HepG2和U251细胞在12 hpi检测到NP蛋白，24 hpi病毒载量达约10⁹ copies/μL，滴度约10⁷ TCID₅₀/mL；KYSE-30细胞在18 hpi出现NP信号，24 hpi病毒载量约10⁷ copies/μL，滴度约10⁵ TCID₅₀/mL。MCF-7、TE-10、KYSE-410细胞在所有时间点均无病毒复制，确认为非易感细胞系。

**3.4 PDCoV在多种鼠细胞系中有效复制**
CT26.WT、MC-38、Neuro-2a细胞在感染后12 hpi检测到NP蛋白，24 hpi达到高峰。RT-qPCR和TCID₅₀结果一致显示病毒RNA和感染性滴度随时间稳步上升，证明PDCoV可在鼠细胞系中高效复制。

**3.5 猫CRFK和F81细胞对PDCoV感染易感**
CRFK细胞在12 hpi出现NP信号，Western blotting显示NP蛋白从12 hpi到24 hpi逐渐积累（相对强度1.00→1.15→1.27），病毒载量和滴度在24 hpi达峰值。F81细胞在18 hpi出现NP信号，24 hpi增强（相对强度1.00→1.18），病毒RNA和滴度同样呈时间依赖性上升，表明猫细胞系对PDCoV易感。

**3.6 不同宿主来源细胞系中APN的相对表达谱**
系统发育分析显示APN基因在脊椎动物中形成清晰分支，与物种分类一致。RT-qPCR检测14种细胞系中APN mRNA水平，以LLC-PK1细胞为基准，发现高度易感细胞系（H1299、Caco-2、MC-38、U251、Neuro-2a）的APN表达相对较高，而非易感细胞系（MCF-7、TE-10、KYSE-410）的APN表达极低，提示基础APN表达水平与细胞对PDCoV的易感性呈正相关。

**讨论与结论**
讨论部分指出，PDCoV具有广泛的体外宿主嗜性，能在人、鼠、猫来源的多种细胞系中复制，尤其在人肺（H1299）和结直肠（Caco-2）细胞中复制效率最高，这与冠状病毒引起呼吸道和肠道疾病的特征相符。胰蛋白酶的作用机制在于切割S蛋白的S1/S2位点，促进膜融合；但高度易感细胞系可能内源性表达充足蛋白酶，故无需外源胰蛋白酶。猫细胞系虽在体外易感，但体内猫可能因受体结合弱、缺乏激活蛋白酶或强抗病毒免疫等因素而不被感染。APN表达与易感性的相关性进一步证实APN作为PDCoV受体或辅助因子的关键作用。研究结论如下：本研究证明胰蛋白酶对PDCoV复制具有细胞类型特异性调节作用；人细胞（H1299、Caco-2）和小鼠MC-38对PDCoV高度易感，而MCF-7、TE-10、KYSE-410完全不支持；本研究还揭示了APN表达与细胞对PDCoV易感性之间的潜在相关性；迫切需要利用体内动物模型评估PDCoV的传播性并研究其传播动力学。