在存在和不存在抗病毒药物的情况下，携带与Letermovir耐药相关的UL56末端酶亚基变化的巨细胞病毒突变体的竞争适应度

《Viruses》：Competitive Fitness of Cytomegalovirus Mutants Bearing Changes in the UL56 Terminase Subunit, Associated with Letermovir-Resistance, in Presence and Absence of Antivirals

　　

Letermovir (LMV) 作为一种巨细胞病毒 (CMV) 末端酶抑制剂，具有较低的耐药性产生遗传屏障，末端酶亚基 (UL51, UL56, UL89) 的单点突变与LMV耐药性 (LMV-R) 相关。研究人员在存在和不存在抗CMV药物的情况下，通过双重感染竞争试验，测定了不同DNA聚合酶 (pol, UL54) 突变体背景下的LMV-R病毒 (UL56 C325F/W/Y或M236V突变体) 的适应度。经过7天的培养，研究人员通过对UL54或UL56基因进行下一代测序 (NGS) 的靶向测序，对病毒变体进行了定量分析。在不存在抗病毒药物的情况下，UL56 C325F突变体与野生型病毒具有相同的适应度，而C325W/Y突变体的复制能力则有所下降。在LMV作用下与野生型病毒进行竞争培养时，在所有测试的末端酶突变体中，UL56 C325F突变体表现出最高的复制能力。在LMV压力下与DNA pol突变体病毒进行竞争培养时，UL56末端酶突变体的复制能力增强，其中末端酶突变体UL56 C325F能够超过多种DNA pol突变体大量生长。此外，当UL56 C325F突变体与另一个UL56末端酶突变体进行竞争培养时，它也表现出最高的复制能力。研究人员的结论与临床上鉴定出的最频繁的LMV-R突变体为C325F UL56突变体的结果相一致。

该研究论文发表于《Viruses》，探讨了在抗病毒药物存在和不存在的情况下，携带与Letermovir耐药相关的UL56末端酶亚基突变的巨细胞病毒突变体的竞争适应度。Letermovir (LMV) 是一种CMV末端酶抑制剂，于2018年获批用于预防成人异基因造血干细胞移植 (HSCT) 后CMV血清阳性受者 (R+) 的CMV感染。尽管其已率先应用于HSCT患者并随后扩展至实体器官移植 (SOT) 领域，但LMV在阻断耐药性产生方面的遗传屏障相对较低。在临床环境中，早期单一感染实验表明，赋予LMV耐药性的突变可能对病毒的生长适应度仅有极小影响。然而，这种传统单感染评估方法无法准确反映临床真实情况，即在遗传多样性和异质性耐药病毒群体共存的环境中，不同病毒变体之间的相互作用与竞争机制尚不明确。为了阐明这一关键问题并理解抗病毒治疗压力下的病毒群体动力学，研究人员开展了这项研究。研究得出结论，UL56 C325F突变体在药压下具有卓越的复制适应度且无适应性代价，这解释了其在临床上的高流行率，对临床监测耐药变异和指导联合用药具有重要的现实意义。

研究人员为开展研究主要采用了以下关键技术方法：靶基因下一代测序 (NGS) 技术用于精准定量双重感染中的病毒变体频率；双重感染竞争试验，在胚肺 (HEL) 成纤维细胞中将参考野生型毒株与突变体按50:50比例共培养，以模拟病毒的群体竞争环境；细胞病变效应 (CPE) 减少试验，用于测定各突变病毒株对不同抗病毒药物的半数有效浓度 (EC50) 和耐药倍数。研究所用的部分耐药株由相关医学中心惠赠，其余则在实验室内通过相应药物压力筛选分离，所有病毒克隆的纯度均通过深度测序验证以确保大于99%的变异频率，并在多种抗病毒药物（如Letermovir、Ganciclovir、Cidofovir、Foscarnet等）的不同浓度压力下进行动态评估。

野生型与突变病毒的基因型与表型鉴定
通过NGS分析，研究人员确保了用于竞争试验的突变异质性极低。在表型研究中结果显明，各类DNA pol突变体对特定的核苷类似物表现出高度特异性的交叉耐药模式，如A987G和K513N突变体对CDV和GCV表现出交叉耐药，却保留对阿昔洛韦 (ACV) 和膦甲酸 (PFA) 的敏感性，甚至对PME衍生物表现出超敏现象。同时，评估的四种UL56末端酶突变体均对LMV产生极高水平的耐药性，但完全保留了对各类CMV DNA pol抑制剂的敏感性。

CMV UL56末端酶突变体与野生型病毒竞争的适应度
在无药压或针对DNA pol抑制剂的药物压力下，UL56 C325F突变体保持了与野生型病毒等同的适应度；但在LMV压力下，该突变体展现出巨大的适应度优势，其群体频率在第7天显著上升。相比之下，C325W和C325Y突变体在无药压时适应度明显受损，虽有LMV能部分恢复其复制能力，但依然弱于野生型。V236M突变体则不受各类DNA pol抑制剂影响，仅在LMV作用下频率增加。

两种CMV UL56末端酶突变体共培养的竞争适应度
通过将不同UL56突变体共培养发现，C325F突变体在无药压及各类药物压力下均表现出优于C325W突变体的复制能力。在与V236M的竞争中，C325F在LMV特定浓度下的复制能力同样占据绝对优势。这些发现独立于药物选择压力解释了为何C325F突变在临床LMV耐药病例中占据主导地位。

UL54 DNA聚合酶突变体与野生型病毒竞争的适应度
评估表明，DNA pol突变体对其产生耐药的药物下获得适应度优势，而在对其超敏的药物条件下则适应度下降。例如，A987V突变体在CDV和GCV压力下适应度增加，而F412L & Q783R双重突变体在无药压下适应度低于野生型，但在CDV压力下因高度耐药而获得显著的适应度攀升。

UL56末端酶突变体与DNA聚合酶突变体之间的竞争适应度
当UL56 C325F与不同DNA pol突变体共培养时，在无药压或针对DNA pol抑制剂的培养基中，其适应度等于或低于DNA pol突变体；但在LMV压力下，C325F突变体获得了显著的复制优势并能够压制各类DNA pol突变体。而C325W和C325Y突变体在与DNA pol突变体的竞争中，虽然在LMV压力下也能恢复部分复制能力，但未能系统性地超越DNA pol突变体。

在讨论与总结部分，研究人员指出，病毒进化中耐药突变的适应度代价是决定其流行性的关键。传统基于单一感染的评估方法存在局限性，而双重感染竞争试验更能真实反映临床中复杂的病毒群动态。研究结论强调了双重感染竞争试验在评价病毒适应度中的重要性，确认了病毒适应度受到竞争环境和药物压力的复杂影响。此外，与C325W/Y等突变不同，UL56 C325F突变在赋予高水平LMV耐药性的同时没有产生显著的适应度代价，确保了其即使在没有药物压力的情况下也能维持与野生型相当的存活与传播能力。因此，一旦C325F突变在临床上出现，它能迅速成为优势毒株。研究建议，在治疗活动性CMV感染时应密切监测耐药突变，并通过具有不同作用机制的抗病毒药物联合使用策略来应对日益严峻的CMV耐药及交叉耐药挑战。