AoraPBP3在苹褐卷蛾（鳞翅目：卷蛾科）中的表达与结合特性

《Biology》：Expression and Binding Characteristics of AoraPBP3 in Adoxophyes orana (Lepidoptera: Tortricidae)

　　

苹褐卷蛾（Adoxophyes orana）是一种主要的卷叶害虫，从亚洲到中欧危害果树。苹褐卷蛾的性信息素（SP）包括Z9-14:Ac、Z11-14:Ac、Z9-14:OH、Z11-14:OH和E9-14:Ac。在本研究中，研究人员结合实验和计算方法，表征了AoraPBP3的配体结合特性。反转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）分析表明，AoraPBP3在两性触角以及雄性翅膀中高表达，且雄性触角中的转录水平显著高于雌性。荧光竞争结合试验（FCBAs）显示，AoraPBP3对Z11-14:Ac表现出最高的结合亲和力，而对Z11-14:OH无可检测的亲和力。同时，AoraPBP3与六种寄主植物挥发物（HPVs）结合，对梨酯表现出强烈偏好。评估AoraPBP3与五种SP组分相互作用的分子动力学（MD）模拟表明，AoraPBP3–Z11-14:Ac复合物具有最低的结合能。相反，在AoraPBP3–Z11-14:OH复合物中观察到高均方根偏差（RMSD），这可能归因于在整个模拟轨迹中AoraPBP3与Z11-14:OH之间的距离过短。通过阐明AoraPBP3对SP组分和寄主植物识别的功能和结构结合机制，这项工作将为开发针对性的交配干扰策略以控制果园中的苹褐卷蛾种群提供有价值的见解。

苹褐卷蛾（Adoxophyes orana）是一种广泛分布于亚洲至中欧、危害多种果树（如苹果、梨、桃、核桃等）的卷叶害虫，其幼虫取食叶片并导致果实表面损伤，进而引发真菌感染，降低果实品质和商品价值。该物种的性信息素（SP）由五种组分（Z9-14:Ac、Z11-14:Ac、Z9-14:OH、Z11-14:OH和E9-14:Ac）组成，介导求偶和交配行为。昆虫嗅觉系统依赖气味结合蛋白（OBPs）将疏水性气味分子运输至嗅觉受体，其中信息素结合蛋白（PBPs）在性信息素识别中起关键作用。尽管在卷蛾科（Tortricidae）的多个亚科中已有PBP功能研究，但苹褐卷蛾（属于卷蛾亚科）中PBP3的配体结合机制尚不明确，尤其缺乏分子对接和分子动力学（MD）模拟的深入分析。因此，研究人员开展本研究，旨在阐明AoraPBP3的表达模式、结合特性及结构机制，为开发基于性信息素干扰的交配控制策略提供理论基础。该论文发表在《Biology》。

研究人员通过以下关键技术方法开展研究：首先，从中国陕西甘泉苹果园采集苹褐卷蛾幼虫并建立实验室种群，提取成虫不同组织（触角、头、胸、腹、足、翅）的RNA，利用反转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）分析AoraPBP3的表达模式。其次，通过原核表达获得重组AoraPBP3蛋白，采用荧光竞争结合试验（FCBAs）测定其对五种SP组分和47种寄主植物挥发物（HPVs）的结合亲和力。最后，利用AlphaFold2预测AoraPBP3三维结构，结合分子对接和800 ns的MD模拟（AMBER99SB力场、TIP3P水模型），计算复合物的结合自由能及残基能量分解，揭示关键相互作用残基。

研究结果如下：

**3.1 AoraPBP3的序列分析与表达谱**
通过序列比对发现，AoraPBP3编码164个氨基酸，含有六个保守半胱氨酸，其二级结构包含七个α-螺旋（α1–α7）。与九种鳞翅目昆虫PBP3同源物的氨基酸序列相似性为59.15%–93.92%，其中与云杉卷叶蛾（Choristoneura fumiferana）的CfumPBP3相似性最高（93.92%）。RT-qPCR结果显示，AoraPBP3在两性触角中高表达，且雄性触角表达量显著高于雌性；此外，在雄性翅膀中也检测到较高表达水平。这一表达模式与部分其他蛾类PBP3一致，但翅膀中的高表达可能暗示额外功能。

**3.2 重组AoraPBP3的结合特性**
荧光竞争结合试验（FCBAs）表明，重组AoraPBP3对1-NPN的K_d为3.04 μM，确认1-NPN可作为合适探针。在五种SP组分中，AoraPBP3对Z11-14:Ac的结合亲和力最高（Ki最低），其次为Z9-14:Ac、E9-14:Ac和Z9-14:OH，而对Z11-14:OH无检测到结合。在47种HPVs中，AoraPBP3对梨酯（pear ester）表现出最强结合，其次为邻苯二甲酸二丁酯、丁酸丁酯和α-法尼烯。该结果证实AoraPBP3不仅参与性信息素识别，还能识别部分寄主植物挥发物。

**3.3 结构建模、分子对接与MD模拟**
AlphaFold2预测的AoraPBP3三维结构包含七个α-螺旋，Ramachandran图验证模型质量良好。分子对接显示多个疏水残基构成结合腔，介导与SP分子的相互作用。800 ns MD模拟的均方根偏差（RMSD）曲线表明，AoraPBP3与Z9-14:Ac、Z11-14:Ac、Z9-14:OH和E9-14:Ac形成的复合物在40–300 ns内趋于稳定；而AoraPBP3–Z11-14:OH复合物的RMSD在三个重复中均出现大幅波动（尤其在300–600 ns阶段），表明其结合状态高度不稳定。质心距离分析进一步支持这一结论：AoraPBP3与Z11-14:OH的质心距离在模拟中相对较短，可能引发不利的排斥作用。回转半径（Rg）显示所有复合物均保持紧凑构象（约1.5 nm）。均方根涨落（RMSF）分析表明，AoraPBP3的N端和C端区域（<8 aa和>138 aa）柔性较高，而环区（loop 1、5、6）的波动在不同复合物间存在差异，部分对应于结合亲和力差异。

**3.4 结合自由能计算与残基能量分解**
基于800 ns MD轨迹的结合自由能（ΔG_bind）计算显示，范德华力（ΔG_vdW）在所有复合物中贡献最大。AoraPBP3–Z11-14:Ac复合物的总ΔG_bind最低，而AoraPBP3–Z11-14:OH复合物的ΔG_bind最高，与FCBAs结果一致。残基能量分解表明，Phe18在所有五个复合物中贡献最低的结合自由能（即最大稳定作用），Phe124和Leu100也普遍贡献显著；Ile58对三种酯类（Z9-14:Ac、Z11-14:Ac、E9-14:Ac）结合有重要贡献，但对两种醇类（Z9-14:OH、Z11-14:OH）贡献较小；Ala117和Ile120特异性地增强了对Z11-14:Ac的结合，可能与AoraPBP3对该配体的最高亲和力相关。

讨论部分指出，AoraPBP3在雄性翅膀中的高表达在卷蛾亚科中是否普遍尚需免疫细胞化学定位验证。与多种鳞翅目昆虫PBP3相比，AoraPBP3的结合谱既有共性（如优先结合酯类组分）也有特异性。MD模拟结果与FCBAs高度一致，证实了Z11-14:Ac为最优配体，而Z11-14:OH因过短距离导致不稳定结合。关键残基Phe18、Ile120、Phe124等未来需通过定点突变进一步验证。

研究结论翻译如下：总之，AoraPBP3在两性触角和雄性翅膀中高表达。FCBAs揭示AoraPBP3对Z11-14:Ac结合亲和力最高，其次为Z9-14:Ac、E9-14:Ac和Z9-14:OH，对Z11-14:OH无结合。在HPVs中，AoraPBP3优先结合梨酯。此外，MD模拟鉴定出Phe18、Ile120和Phe124是驱动这些信息素相互作用的关键残基。综合来看，这些见解阐明了蛾类PBP3的结构机制，有助于优化和增强基于信息素的害虫防治策略。