从冬虫夏草发酵产物中分离的具有光防护和重金属解毒活性的黑色素组分

《Biology》：Photoprotective and Heavy Metal-Detoxifying Melanin Fractions Isolated from Ophiocordyceps sinensis Fermentation Products

　　

黑色素是一种具有广泛生物活性的天然生物聚合物，然而针对药用真菌冬虫夏草黑色素的研究仍然不足。本研究从其发酵产物中分离出两种黑色素组分TZ-a和TZ-b，并通过傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、扫描电子显微镜(SEM)、热重分析(TGA)和紫外-可见光谱(UV-Vis)对其进行表征。研究人员评估了它们对角质形成细胞紫外线B(UVB)诱导损伤的保护作用以及对重金属(Cd²⁺、Pb²⁺、As³⁺、Hg²⁺)细胞毒性的防护效果。两种组分均表现出黑色素的特征峰但存在结构差异。TZ-a呈片状或针状晶体，而TZ-b形成块状聚集体。两者均表现出良好的热稳定性。UV-Vis光谱证实了它们典型的黑色素特性。在200 μg/mL浓度下，TZ-a和TZ-b将细胞存活率从约50%（模型组）分别提高到80.59%和82.48%。此外，它们将凋亡细胞群中的存活细胞比例从59.11%分别提升至86.08%和84.79%。两种组分以浓度依赖性方式缓解重金属诱导的细胞毒性，降低丙二醛(MDA)水平并恢复谷胱甘肽(GSH)池。总之，源自冬虫夏草的黑色素组分TZ-a和TZ-b表现出光防护作用并缓解了重金属毒性。

黑色素是由酚类或吲哚单体氧化聚合而成的复杂聚合物，广泛分布于动植物和微生物中。冬虫夏草作为一种珍贵的药用真菌，传统上用于滋补肺肾和增强免疫力。尽管其含有多糖和虫草素等多种活性成分，但针对其黑色素的研究依然有限。现有研究虽已从其发酵液中分离出黑色素并证实了其自由基清除和铁离子螯合活性，但该黑色素的结构异质性及更广泛的生物学活性尚未得到彻底探讨。黑色素分子中富含羟基、羧基、氨基和酚羟基等官能团，赋予其抗氧化、抗辐射和重金属螯合的特性。紫外线B(UVB，280–320 nm)辐射会诱导细胞内活性氧(ROS)过度产生并引发氧化应激，导致DNA损伤和细胞凋亡，进而加速皮肤老化与癌变。同时，铅、镉等重金属离子可通过食物链进入人体诱发氧化应激。虽然天然黑色素可作为紫外线吸收剂和抗氧化剂，且能通过金属螯合能力结合重金属离子以缓解毒性，但针对冬虫夏草黑色素在此类防护领域的应用研究十分匮乏。为此，研究人员开展了相关研究，期望为其在功能性食品、化妆品及环境修复中的应用提供理论支撑。该研究成果已发表于《Biology》期刊。

在关键技术方法方面，研究使用的菌种冬虫夏草TZ8-1保存于兰州交通大学特种食药用菌实验室。研究人员基于前期建立的液体发酵条件获取发酵液，经过酸碱调节、离心、有机溶剂洗涤及冷冻干燥提取出粗黑色素，随后采用硅胶柱层析技术将其分离纯化为TZ-a和TZ-b两个组分。在结构表征上，运用扫描电子显微镜(SEM)观察微观形态，傅里叶变换红外光谱(FT-IR)分析官能团，热重分析(TGA)评估热稳定性，紫外-可见光谱(UV-Vis)鉴定最大吸收峰。在活性评估中，以人表皮角质形成细胞(NHEK)为实验模型，通过CCK-8法测定细胞存活率，利用DCFH-DA荧光探针检测活性氧(ROS)水平，采用流式细胞术分析细胞凋亡，并测定细胞内丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量以评估重金属解毒能力。所有实验数据通过单因素方差分析进行统计比对。

在物理和化学表征分析中，通过SEM分析得出，TZ-a主要呈现片状或针状晶体形态，且分散性良好；而TZ-b则形成边界模糊、表面粗糙的大块状聚集体，表明二者具有截然不同的形态特征。FT-IR分析表明，TZ-a和TZ-b均具有典型的黑色素芳香骨架和官能团特征。TZ-a光谱中包含酰胺基团的特征吸收峰，而TZ-b则保留了完整的芳香骨架和脂肪族侧链，揭示了两组分在结构上的异质性。TGA分析显示，在从室温升至700 ℃的过程中，TZ-a和TZ-b表现出持续的质量损失。在500 ℃时，两者的质量损失率分别为36%和28%；在700 ℃时，分别为48%和39%。这表明两种组分均具备良好的热稳定性，且TZ-b的热稳定性优于TZ-a。UV-Vis分析测定出TZ-a和TZ-b分别在210 nm和215 nm处有最大吸收峰，证实了其典型黑色素的强紫外光吸收特性。

在光防护活性分析方面，首先通过细胞存活率测定得出，在UVB辐射下，TZ-a和TZ-b以浓度依赖性方式提高了NHEK细胞的存活率。在200 μg/mL浓度下，两者的干预使细胞存活率分别提升至80.59%和82.48%，展现出强效的光防护潜力。其次，通过ROS生成测定得出，UVB辐射显著增加了模型组细胞内的ROS积累，而经TZ-a或TZ-b预处理后，ROS水平被显著下调（分别降至约46%和31%），证实了其强效的ROS清除活性，其中TZ-b表现出略优的自由基淬灭能力。最后，通过细胞凋亡分析得出，UVB辐射导致早期和晚期凋亡细胞比例大幅增加，活细胞比例锐减至59.11%。而在接受TZ-a或TZ-b干预后，早期和晚期凋亡比例均显著降低，凋亡群中的活细胞比例回升至86.08%（TZ-a）和84.79%（TZ-b），有效减缓了UVB诱导的细胞凋亡进程。

在重金属缓解能力分析方面，通过细胞存活率评估得出，在四种重金属离子环境中，TZ-a和TZ-b均能以浓度依赖方式缓解细胞毒性，其中对Hg²⁺毒性的防护效果最为显著，在最高浓度下细胞存活率均超过80%。通过MDA含量测定得出，重金属暴露显著诱导了细胞内的脂质过氧化，而经TZ-a或TZ-b干预后，胞内MDA水平大幅降低；其中TZ-b在四种重金属环境中对MDA生成的抑制作用普遍强于TZ-a，表现出更优的抗氧化效力。通过GSH含量测定得出，重金属暴露会耗竭细胞内抗氧化GSH池，而TZ-a和TZ-b均能将GSH水平恢复至接近正常对照组；其中TZ-a在恢复GSH储备方面略优于TZ-b，提示这两种组分可能通过互补的机制发挥抗氧化作用。

在结论部分，研究人员总结道，本研究成功从冬虫夏草发酵产物中分离出黑色素组分TZ-a和TZ-b。结构表征证实了它们的黑色素特性及结构差异，其中TZ-a含硫，呈片状或针状；TZ-b趋向于形成无定形块状物，且TZ-b的热稳定性优于TZ-a。生物学评估表明，两者均能有效对抗UVB诱导的角质形成细胞损伤，显著提高细胞存活率、抑制ROS积累并减少细胞凋亡。此外，两者均能浓度依赖性地缓解重金属诱导的细胞毒性，显著降低MDA水平并恢复GSH库。这种光防护与重金属缓解能力主要归因于其表面的酚羟基、羧基等官能团所具备的金属螯合和自由基清除作用。这些发现突显了这两种天然真菌色素作为有效成分用于预防皮肤光老化、重金属毒性及氧化应激相关疾病的巨大潜力。尽管当前研究尚未对这两种组分的直接金属螯合能力进行量化，但其出色的细胞保护效力已为后续开发相关功能产品奠定了坚实的理论依据。