转录组学证据鉴定胶质瘤中具有相反预后关联的两种TMBIM亚群

《Biology》：Transcriptomic Evidence Identifies Two TMBIM Subgroups with Opposing Prognostic Associations in Glioma

　　

胶质瘤是最常见且具有侵袭性的原发性脑肿瘤，其中胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GB）预后较差且治疗反应有限。细胞内离子稳态失调，特别是Ca2+信号传导，已成为胶质瘤进展的关键促成因素。跨膜BAX抑制剂基序包含（Transmembrane BAX Inhibitor Motif-Containing, TMBIM）蛋白家族调节细胞内Ca2+通量和细胞存活；然而，其在胶质瘤中的作用仍不完全清楚。研究人员分析了来自TCGA、CGGA和Rembrandt队列的基因表达及临床数据，以评估TMBIM1-6表达、肿瘤分级与患者生存之间的关联。相关性分析鉴定了TMBIM相关的基因网络，随后进行功能富集以表征潜在的生物学过程和分子功能。TMBIM家族成员分为具有相反临床关联的两个不同群组。TMBIM1、TMBIM4和TMBIM6上调并与较差的患者生存相关，而TMBIM2、TMBIM3和TMBIM5下调并与生存增加相关。功能富集分析揭示了两种保守的基因表达程序：TMBIM1/4/6与膜运输、代谢和生物能量适应相关，而TMBIM2/3/5与细胞周期调控和染色体不稳定性相关。这些发现揭示了胶质瘤中TMBIM家族先前未被认识的功能分化。这种二分组织结构凸显了TMBIM蛋白作为潜在预后标志物的价值，并表明选择性靶向特定TMBIM亚群可能改善治疗策略。

研究背景方面，胶质瘤是最常见的且具有治疗挑战性的原发性脑肿瘤，具有高异质性和较差的患者结局，尤其是高级别亚型如胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GB）。根据肿瘤侵袭性、组织学和分子遗传标志物，胶质瘤分为四级，IV级对应于GB，是所有胶质瘤中最严重的形式。尽管约占所有原发性脑肿瘤的30%，胶质瘤却占恶性脑肿瘤的80%，是脑肿瘤相关死亡的主要原因。尽管近期癌症治疗有所进展，但由于固有的肿瘤特征和血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）的存在限制了血液循环药物递送至大脑，预后和患者生存仍然有限。这凸显了深入理解驱动胶质瘤进展的分子机制以及其治疗抵抗和频繁复发的迫切需求。胶质瘤进展涉及控制细胞增殖、凋亡、侵袭和代谢重编程的复杂调控网络。胶质瘤生物学的新兴特征包括细胞内运输、离子通量和分泌途径的失调，影响肿瘤细胞存活、增殖和侵袭。这些过程与离子稳态紧密关联，尤其是钙离子（Ca²⁺）信号传导，其作为第二信使控制细胞周期进程、细胞骨架动力学和细胞应激反应，并在调节细胞命运决定中发挥核心作用。细胞内Ca²⁺稳态的改变通常由质膜及细胞内细胞器如内质网（Endoplasmic Reticulum, ER）、高尔基体（Golgi Apparatus, GA）、分泌途径囊泡和线粒体中通道的异常活性驱动。因此，Ca²⁺通道是胶质瘤进展的潜在关键调节因子，可能代表有前景的治疗靶点。跨膜BAX抑制剂基序包含（Transmembrane BAX Inhibitor Motif-Containing, TMBIM）蛋白家族成员被报道可调节细胞内Ca²⁺和细胞存活。TMBIM家族包含六个进化保守的通道（TMBIM1-6），这些蛋白调节细胞内细胞器膜间的细胞内Ca²⁺通量，也影响细胞内和细胞外空间之间的离子通量。TMBIM蛋白具有不同的亚细胞定位，包括ER（TMBIM2-3和TMBIM6）、GA（TMBIM1-4）、线粒体（TMBIM5）、溶酶体和内体（TMBIM1）甚至质膜（TMBIM2），与其维持细胞稳态的作用相关。这种定位在某些情况下可根据表达水平或细胞类型而变化。通过其对于Ca²⁺通量、线粒体代谢状态、ER应激反应、自噬、细胞运动和凋亡的影响，TMBIM蛋白已被涉及癌症进展。然而，关于每个TMBIM蛋白在胶质瘤中发挥的不同作用的全面理解仍然缺乏，特别是其与肿瘤分级、患者生存和整体分子机制的关联。因此，研究人员表征了胶质瘤中TMBIM1-6的表达谱，并评估其与肿瘤分级、患者生存和与肿瘤进展相关的细胞机制的关联，首次描述了TMBIM1、4和6与TMBIM2、3和5形成不同的聚类，显示出与肿瘤分级、患者生存和基因表达的相反相关性。这些发现凸显了TMBIM家族中先前未被认识的功能分化，对指导未来涉及特定TMBIM抑制的选择性治疗策略开发尤为重要。该研究论文发表在《Biology》。

研究人员为开展研究用到的主要关键技术方法包括：从The Cancer Genome Atlas-Glioblastoma and Low-Grade Glioma（TCGA-GBMLGG）队列（667例患者，152例GB和515例LGG，RNA测序基因表达谱）、Rembrandt队列（444例患者，219例GB和225例LGG，微阵列技术基因表达谱）以及Chinese Glioma Genome Atlas（CGGA）数据集（301例患者，174例GB、124例LGG和2例未定义，mRNA微阵列）获取患者层面基因组和临床数据。通过单因素方差分析（One-Way ANOVA）评估TMBIM家族基因表达与胶质瘤肿瘤分级（II-IV）及异柠檬酸脱氢酶1（Isocitrate Dehydrogenase 1, IDH）状态的关联，ANOVA显著后应用Tukey诚实显著差异（Honest Significant Difference, HSD）事后检验。通过Kaplan-Meier生存分析和Cox比例风险回归模型评估TMBIM家族基因表达与胶质瘤患者总生存（Overall Survival, OS）的关联，以各数据集内中位基因表达将患者分为高和低表达组，计算风险比（Hazard Ratios, HRs）及95%置信区间（Confidence Intervals, CIs）并加权中位数整合跨队列结果。通过皮尔逊相关系数（Pearson Correlation Coefficient, PCC）识别与TMBIM1-6表达相关性最强的基因，设定绝对相关阈值PCC大于0.4或小于负0.4，并在TCGA-GBMLGG和Rembrandt数据集及TCGA-GBM（GB，IV级胶质瘤）和TCGA-LGG（II和III级胶质瘤）亚型中分别分析，量化共享和相反相关基因百分比，计算TMBIM家族成员间成对表达相关性。对鉴定的TCGA-GBMLGG基因集取交集后进行基因本体（Gene Ontology, GO）生物学过程（Biological Process, BP）和分子功能（Molecular Function, MF）富集分析，使用clusterProfiler包，过滤错误发现率（False Discovery Rate, FDR）小于0.05并按富集倍数排序选取每类本体前十个术语，使用SRplot可视化桑基图。

研究结果部分，首先是3.1. TMBIM家族中相反胶质瘤患者生存关联。由于TMBIM家族调节细胞内离子通量和与胶质瘤进展关键特征相关的若干细胞过程如细胞侵袭、增殖和代谢重编程，研究人员调查这些基因与胶质瘤患者结局的可能关联。通过使用中位表达 cutoff 分层高和低表达组评估TMBIM基因表达与胶质瘤患者总生存的关联。Kaplan-Meier生存分析显示在TMBIM家族成员中存在不同的生存模式。TMBIM1、TMBIM4和TMBIM6的高表达与生存降低显著相关，而TMBIM2、TMBIM3和TMBIM5的高表达与总生存增加相关，该模式在TCGA和CGGA队列中观察到，在Rembrandt数据集中检测到相同方向趋势但TMBIM2和TMBIM3关联未达到统计学显著性（p大于0.05）。Cox比例风险分析确认这些发现，TMBIM1、TMBIM4和TMBIM6显示HR大于1，而TMBIM2、TMBIM3和TMBIM5显示HR小于1，三个独立数据集一致观察到这些关联支持预后分层的稳健性。

其次是3.2. TMBIM家族成员在胶质瘤进展期间表现出不同的表达趋势。为研究TMBIM家族表达与肿瘤进展的关系，分析II至IV级胶质瘤的基因表达。TMBIM家族成员表现出两种截然相反且与分级相关的表达模式（TCGA和Rembrandt数据集）。TMBIM1、TMBIM4和TMBIM6随肿瘤分级进展表达逐渐增加（图2A-C），而TMBIM2、TMBIM3和TMBIM5从II级到IV级逐渐降低（图2D-F）。II级和IV级之间这种依赖分级的表达变化在两个数据集中均具有统计学显著性（p小于0.001），支持TMBIM转录谱与胶质瘤恶性进展的一致关联。根据WHO中枢神经系统肿瘤分类第5版（WHO CNS5）的新成人型弥漫性胶质瘤分类，最具侵袭性的胶质瘤类型（胶质母细胞瘤，IV级）基于IDH状态（野生型wild type, wt或突变型mutant）分类。分析TMBIM表达与IDH状态的关联，数据支持TMBIM1、TMBIM4和TMBIM6在IDHwt胶质瘤中更高表达，而TMBIM2、TMBIM3和TMBIM5在IDHmutant胶质瘤中更高表达。重要的是，依赖分级和IDH状态的表达变化方向与观察到的生存关联一致，进一步支持TMBIM家族成员在胶质瘤中的预后相关性。

接着是3.3. TMBIM转录相关基因定义两种不同景观。为研究每个TMBIM家族成员与其在胶质瘤中相关转录景观的关系，使用TCGA（图3A,B）和Rembrandt数据集（图S2）鉴定每个TMBIM的300个表达相关系数最高的基因。对于每个TMBIM，评估这300个基因与其余五个TMBIM家族成员的表达相关性。观察到与TMBIM1、TMBIM4和TMBIM6高度相关的基因之间存在高水平重叠，在该亚组内显示相似的相关模式（图3A）。共失调基因量化显示其各自基因集之间实质性百分比重叠（图3C）。相比之下，与TMBIM2、TMBIM3和TMBIM5相关的基因表现出相反的相关谱（图3B,C）。有趣的是，高百分比的TMBIM2共失调基因与TMBIM4和TMBIM6显示相反的失调趋势（正vs负）（图3C）。一致地，TMBIM家族成员间的直接相关分析揭示TMBIM1、4和6之间的强正相关，而这些基因与TMBIM2、3和5呈负相关（图3D）。重要的是，这种二分相关模式在TCGA和Rembrandt数据集中均可重现。对TCGA数据集的LGG和GB分别进行相关分析，TMBIM相关基因集之间的相反相关模式得以保留（图3E,F）。然而，这些关系的强度在肿瘤亚型之间不同。在GB中，TMBIM1、4和6之间的共享转录景观更显著，而涉及与TMBIM2、3和5相关基因的相关性似乎更分散。相反，在LGG中，与TMBIM4、2、3和5相关的基因集观察到更强的相关结构，而TMBIM1和TMBIM6的转录关联在GB中更突出。这些相关景观的差异可能反映了LGG和GB之间公认的转录分化。尽管存在这些变异，LGG和GB在TMBIM成员间具有一致相关趋势的基因方面表现出实质性重叠（图3G），与TMBIM基因间一致的相关关系一致（图3H）。TMBIM3观察到例外情况，显示相对较弱的相关性，与TMBIM2和TMBIM5相关基因的关联适中，尤其在GB中。总之，这些发现表明核心TMBIM转录网络在胶质瘤级别中很大程度上保留，而其相对强度和组织在LGG和GB之间变化。这些转录关系在LGG和GB中的保留表明TMBIM相关细胞过程与肿瘤进展期间胶质瘤转录重组相关。

然后是3.4. 功能基因富集支持两种TMBIM相关转录程序。为研究与TMBIM相关基因相关的细胞过程，对表达模式与不同TMBIM家族成员相关的基因进行功能富集分析（图4）。与TMBIM1和TMBIM4相关的基因在聚糖降解和TNF介导的信号通路调节中显著富集。与TMBIM4和TMBIM6相关的基因与溶酶体和血管酸化及突触囊泡定位、回收和自噬相关。TMBIM1/4和TMBIM4/6相关基因的分子功能分析也突出了脂肪酶和磷脂酶抑制剂活性。相比之下，与TMBIM3和TMBIM5相关的基因与动粒组织和染色体凝聚相关途径相关，细胞骨架组织和微管马达活性成为最丰富的分子功能。与TMBIM2和TMBIM3相关的基因仅显示适度富集，但细胞周期调控和染色体分离途径是TMBIM3/TMBIM5相关基因集最突出的。与TMBIM2和TMBIM5相关的基因在突触囊泡成熟和可塑性中富集。总体而言，观察到的基因富集模式强化了存在两种截然不同的TMBIM相关转录景观。TMBIM1/4/6组与分泌、突触囊泡定位、回收、pH、自噬和脂肪酶/磷脂酶活性相关途径相关。相反，TMBIM2/3/5轴更多与细胞周期调控、染色体分离/不稳定性和微管细胞骨架相关过程相关，以及在较小程度上与ER管状组织和突触囊泡回收/成熟相关。需要进一步研究阐明TMBIM蛋白1-6贡献于胶质瘤生物学的特定机制，并确定哪些途径与肿瘤进展和治疗反应最相关。

总结讨论部分，该研究揭示了胶质瘤中TMBIM家族先前未被认识的二分转录组织，其特征为相反的预后关联、依赖分级的表达模式和不同的转录网络。在独立数据集中，TMBIM1、TMBIM4和TMBIM6始终与较差的生存和较高肿瘤级别中表达增加相关，而TMBIM2、TMBIM3和TMBIM5显示相反模式。表达相关性分析进一步证明这些基因分离为两个连贯的转录组模式，这种结构在LGG和GB中均保留。功能富集分析支持这种二分法，将TMBIM1/4/6组与突触囊泡处理和脂肪酶/磷脂酶活性相关的生物学过程联系起来，而TMBIM2/3/5轴与细胞周期调控和微管细胞骨架相关过程相关。总之，这些发现表明TMBIM家族成员参与两种不同的转录程序，很可能差异影响或受胶质瘤进展影响。更深入理解这些TMBIM相关调控网络背后的机制可能为胶质瘤生物学提供相关见解，并揭示潜在的预后标志物和治疗靶点。重要的是，此处呈现的数据表明，未来涉及胶质瘤中TMBIM活性或表达操纵的治疗方法的开发必须对特定TMBIM群组具有高度选择性。

翻译研究结论部分为：本研究揭示了胶质瘤中TMBIM家族先前未被认识的二分转录组织，其特征为相反的预后关联、依赖分级的表达模式和不同的转录网络。在独立数据集中，TMBIM1、TMBIM4和TMBIM6始终与较差的生存和较高肿瘤级别中表达增加相关，而TMBIM2、TMBIM3和TMBIM5显示相反模式。表达相关性分析进一步证明这些基因分离为两个连贯的转录组模式，这种结构在低级胶质瘤（Low-Grade Glioma, LGG）和胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GB）中均保留。功能富集分析支持这种二分法，将TMBIM1/4/6组与突触囊泡处理和脂肪酶/磷脂酶活性相关的生物学过程联系起来，而TMBIM2/3/5轴与细胞周期调控和微管细胞骨架相关过程相关。总之，这些发现表明TMBIM家族成员参与两种不同的转录程序，很可能差异影响或受胶质瘤进展影响。更深入理解这些TMBIM相关调控网络背后的机制可能为胶质瘤生物学提供相关见解，并揭示潜在的预后标志物和治疗靶点。重要的是，此处呈现的数据表明，未来涉及胶质瘤中TMBIM活性或表达操纵的治疗方法的开发必须对特定TMBIM群组具有高度选择性。