从阿尔及利亚骆驼奶中分离的粪肠球菌菌株的初步分子表征和抗菌活性

《Life》：Preliminary Molecular Characterization and Antimicrobial Activity of Enterococcus faecium Strains Isolated from Algerian Camel Milk

　　

这项研究对从阿尔及利亚骆驼奶中分离的六株粪肠球菌（Enterococcus faecium）进行了表征，以评估其作为食品相关分离株的分子特征和抗菌潜力。鉴定采用表型试验、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）和16S rRNA基因测序。菌株多样性通过基于重复序列的聚合酶链反应（rep-PCR）评估，包括(GTG)₅-PCR、BOX-PCR和肠杆菌科重复基因间一致性PCR（ERIC-PCR）。聚合酶链反应（PCR）筛查选定的毒力相关和抗菌药物耐药基因显示，两株选定分离株对目标标记物呈阴性，表明具有初步感兴趣的分子图谱，但如果没有全基因组测序和表型抗菌药物敏感性试验，则不能得出最终的安全性结论。两株菌均对革兰阳性和革兰阴性指示菌显示出抗菌活性。菌株9对肺炎克雷伯菌肺炎亚种（Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae）ATCC 13883显示出显著抑制，使用天然上清液时的抑菌圈为23.4 ± 2.3 mm，浓缩后增加。胰蛋白酶处理消除了活性，支持抑制性化合物的蛋白质性质。在菌株9和13中检测到肠球菌素基因entA和entB，仅表明遗传潜力。需要进一步的基因组、安全性和功能性研究。

**论文解读：阿尔及利亚骆驼奶中粪肠球菌菌株的初步分子表征与抗菌活性研究**

**研究背景与问题**
骆驼奶是干旱和半干旱地区（包括阿尔及利亚）重要的营养资源，其微生物群可影响传统乳制品的安全性、质量和功能特性。乳酸菌，尤其是粪肠球菌（Enterococcus faecium，E. faecium），因其在发酵、风味形成、抗菌化合物生产及食品生物保鲜中的潜在作用而备受关注。然而，E. faecium 菌株中同时存在医院相关谱系，如耐万古霉素肠球菌，可能携带抗菌药物耐药性决定簇、毒力相关基因和可移动遗传元件。因此，在考虑将食品相关 E. faecium 菌株用于任何技术应用前，必须进行菌株水平的谨慎评估，筛查毒力相关基因和抗菌药物耐药性决定簇是关键的初步步骤。本研究旨在通过表型、蛋白质组学和分子方法，对阿尔及利亚骆驼奶来源的 E. faecium 分离株进行表征，并评估其对选定指示病原菌的抗菌活性，从而为后续的基因组、安全性和功能性研究奠定基础。该论文发表于《Life》。

**关键技术方法**
研究人员从阿尔及利亚西南部盖尔达耶和贝沙尔地区的四个生骆驼奶样品中分离出六株 E. faecium（编号9、10、11、12、13、17）。主要技术方法包括：利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）和16S rRNA基因测序进行物种鉴定；采用三种基于重复序列的聚合酶链反应（rep-PCR）方法（(GTG)₅-PCR、BOX-PCR和肠杆菌科重复基因间一致性PCR（ERIC-PCR））评估菌株遗传多样性；通过PCR筛选毒力相关基因（cylM、cylA、cob、ccf、gelE、agg、hyl、ace）和抗菌药物耐药基因（vanA、vanB、vanC1、ermA、ermB）以及肠球菌素结构基因（entA、entB等）；最后，通过琼脂扩散法测试中性化细胞上清液对九株ATCC指示菌的抗菌活性，并用胰蛋白酶处理验证抑制物的蛋白质性质。

**研究结果**
**3.1 肠球菌分离株的推定鉴定**
六株分离株均呈革兰阳性、过氧化氢酶阴性球菌，能在4%和6.5% NaCl、pH 9.6及45°C下生长，符合肠球菌属的典型表型特征，初步归为肠球菌属。

**3.2 确认分离株为E. faecium**
MALDI-TOF MS分析显示所有六株菌的log(score)值在2.20至2.34之间（均≥2.0），可靠鉴定至种水平。16S rRNA基因部分测序（约700 bp）与参考序列比对，相似度达98%–99%，进一步确认其为E. faecium。

**3.3 分离株间的系统发育关系**
基于16S rRNA序列的最大似然系统发育树显示，所有六株分离株与E. faecium参考菌株ATCC 19434和DSM 20477聚为一簇，与E. hirae和E. casseliflavus等近缘种分离，支持其种级分类。短分支长度表明菌株间遗传关系密切，符合食品来源E. faecium的特点。

**3.4 rep-PCR揭示的遗传多样性**
(GTG)₅-PCR和BOX-PCR将六株菌分为三个遗传簇，BOX-PCR分辨力更高；ERIC-PCR仅产生两个簇，分辨力较低。三种指纹图谱方法互补，表明菌株间存在种内多样性。

**3.5 毒力相关基因和抗菌药物耐药基因图谱**
初次PCR筛选（cylM、cylA、cob、ccf、gelE）显示，菌株9和13对所有五个目标基因阴性，而其他菌株携带至少一个基因。二次PCR扩展筛查（ddl、agg、hyl、ace、vanA、vanB、vanC1、ermA、ermB）中，菌株9和13同样均为阴性，表明其具有初步感兴趣的分子图谱。

**3.6 选定分离株的肠球菌素基因图谱**
PCR检测显示，菌株9和13扩增出肠球菌素结构基因entA和entB，其他肠球菌素基因（entL50A、entL50B、ent31、entP、entAS-48、entCRL35）均为阴性。这表明两株菌具有产生肠球菌素A和B的遗传潜力。

**3.7 天然和浓缩上清液的抗菌活性**
菌株9和13的中性化上清液（天然和浓缩）均对革兰阳性和革兰阴性指示菌表现出抑制活性。菌株9的浓缩上清液对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和肺炎克雷伯菌肺炎亚种ATCC 13883的抑菌圈显著增大（后者从23.4±2.3 mm增至29.8±6.1 mm）。胰蛋白酶处理完全消除活性，证实抑制物为蛋白质性质。菌株9的活性比菌株13更强且更一致，尤其在浓缩后。

**讨论与结论**
讨论部分总结了研究结果的意义：通过表型、蛋白质组学、分子分型及抗菌活性测试，提供了阿尔及利亚骆驼奶来源E. faecium菌株的初步整合表征。菌株9和13因缺乏所选毒力及耐药基因标记，且具有可检测的蛋白质类抗菌活性，成为值得进一步研究的候选菌株。然而，PCR筛查仅为初步方法，不能排除其他未检测的耐药或毒力因子，需通过全基因组测序（WGS）和表型抗菌药物敏感性试验进行完整安全性评估。此外，生物胺产生能力、抗菌化合物的纯化与结构表征、以及食品模型中的验证也是未来研究重点。研究结论部分翻译如下：
本研究提供了骆驼奶来源E. faecium菌株的初步整合分子与表型表征，并突出了其抗菌潜力。在六株菌中，菌株9和13因缺乏所选毒力相关和耐药标记，且具可检测的蛋白质类抗菌活性，显示出初步感兴趣的分子图谱。值得注意的是，菌株9尽管携带相同的肠球菌素结构基因（entA和entB），但抗菌活性比菌株13更广且更一致，这可能反映了基因表达、调控、抗菌化合物产量或其他菌株依赖性因素差异。这一发现强调了除基因检测外功能表征的重要性。未来工作应聚焦于全基因组测序、扩展的表型安全性评估、生物胺产生能力评估、抗菌化合物表征以及在相关食品模型中的验证，以进一步支持这些菌株的技术评价。总体而言，这些发现将阿尔及利亚骆驼奶确定为具有抗菌潜力的E. faecium菌株的有价值来源，并支持进一步探索其在食品生物技术中的可能应用。