PET生物反应器水平和垂直位置用于香草体外商业繁殖的比较

《Horticulturae》：A Comparison of the Horizontal and Vertical Positions of the PET Bioreactor for In Vitro Commercial Propagation of Vanilla

　　

临时沉浸系统（Temporary Immersion Systems, TIS）代表了微繁殖（micropropagation）领域一种高效、基于生物技术的替代方案。本研究比较了在聚乙烯对苯二甲酸酯（PET）生物反应器中，采用水平位置和垂直位置时，香草（Vanilla planifolia Andrews）芽体在半固体和液体培养基中的体外繁殖（in vitro propagation）情况。在增殖阶段，研究人员通过测量以下发育变量来评估这些PET生物反应器：叶绿素（chlorophyll）含量、气孔密度（stomatal density）、闭合气孔百分比（percentage of closed stomata）以及干物质百分比（dry matter percentage）。此外，在驯化（acclimatization）阶段评估了存活率（survival percentage）。研究结果表明，不同的培养系统在体外增殖期间对所评估的变量产生差异性影响。水平位置和垂直位置的PET生物反应器均产生了更高的每个外植体芽数，以及更高的干物质百分比、气孔密度和闭合气孔百分比。最长的芽体（具有更多叶片和更高叶绿素含量）在水平PET生物反应器中获得。此外，在PET生物反应器中培养的小植株（plantlets）在温室驯化期间表现出最高的存活率。总之，使用PET容器作为临时沉浸生物反应器进行香草体外增殖，代表了一种经济且高效的替代方案，可用于该物种的商业化规模微繁殖。

**研究背景与问题：**
香草（Vanilla planifolia Andrews）是唯一栽培用于提取香兰素（vanillin）的兰花物种，广泛应用于食品、制药和香精工业。然而，其种子繁殖发芽率仅5%，商业上多采用扦插繁殖，但易传播病虫害且无法复壮植株。当前香草被列为濒危物种，在墨西哥受特殊保护。植物组织培养技术如微繁殖（micropropagation）可提高体外再生能力，但传统半固体培养基和密封容器成本高、缺乏自动化。临时沉浸系统（Temporary Immersion Systems, TIS）通过使用液体培养基、半自动化关键阶段并减少劳动力，成为经济有效的替代方案。然而，现有TIS模型（如RITA?、SETIS?、SMIT?）因初始投资高或玻璃容器易碎而受限。聚乙烯对苯二甲酸酯（PET）容器制成的TIB（Temporary Immersion Bioreactor, TIB-PET）低成本、轻便、耐冲击且可回收，但水平与垂直配置对香草繁殖的影响尚需系统比较。因此，本研究旨在比较水平与垂直PET生物反应器在半固体和液体培养基中对香草芽体体外繁殖的影响，以建立商业化规模化的可行方案。论文发表在《Horticulturae》。

**主要关键技术方法（不超过250字）：**
研究使用来自墨西哥韦拉克鲁斯一个商业香草克隆的插条，经表面消毒后，在含8.8 μM苄基腺嘌呤（BA）和4.9 μM吲哚-3-丁酸（IBA）的MS培养基中预培养。随后，将芽体（每个外植体2个芽，长2 cm）接种于4000 mL透明PET容器制成的TIB中，每容器含1000 mL液体MS培养基（20个外植体，50 mL培养基/外植体），设置水平与垂直两种位置，浸没频率为每4小时2分钟，持续60天。对照为相同PET容器中半固体培养基（添加0.28% Gelrite）。所有容器用0.25%次氯酸钠和UV光灭菌。测量变量包括：芽数、芽长、叶片数、干物质百分比（干重/鲜重×100）、气孔指数（SI）、闭合气孔百分比（%CS）、叶绿素a、b和总含量（Chl a, b, t）。驯化阶段取384个无根芽体（3–5 cm，至少2片叶）转移至含堆肥+ tezontle + 锯末（1:1:1 v/v/v）的32孔聚丙烯托盘中，温室条件下（78%遮阴，30±2°C，60–70%相对湿度，PPFD 180±5 μmol m^-2 s^-1）观察90天存活率。数据采用完全随机设计，三次重复，用ANOVA和Tukey检验（p ≤ 0.05）分析。

**研究结果（保留小标题并简要说明发现）：**
**3.1. 不同培养系统对芽体增殖的影响**
通过比较半固体（SS）水平与垂直、TIB（临时沉浸生物反应器）水平与垂直四种系统，发现TIB水平和垂直系统每个外植体芽数最高（分别为18.86和20.26），而SS水平与垂直系统最低（8.7和10.50）。芽长在TIB水平系统中最长（3.04 cm），SS垂直系统最短（1.5 cm）。每芽叶片数在TIB水平系统中最高（2.6），SS垂直系统最低（1.8）。干物质百分比在TIB水平和垂直系统中最高（6.25%和6.35%），SS系统最低（5.34%和5.55%）。
**3.2. 气孔指数（SI）、闭合气孔百分比（%CS）和叶绿素含量**
TIB水平和垂直系统气孔指数（SI）均为24.5%，显著高于SS系统（18.22%和20.00%）。闭合气孔百分比（%CS）在TIB系统中均为0.73%，高于SS系统的0.53%。叶绿素a、b和总含量（Chl a, b, t）在TIB水平系统中最高（0.21, 0.14, 0.35 mg g^-1 FW），SS垂直系统最低（0.10, 0.07, 0.18 mg g^-1 FW），TIB垂直系统Chl b含量（0.09 mg g^-1 FW）也较低。
**3.3. 转移至离体条件：无菌植株的驯化**
TIB水平和垂直系统植株存活率最高（98.6%和98.3%），SS系统最低（91.6%和91.3%）。植株在温室中生长90天后表现健康，随后转移至栽培床用于母株生产，最终用于商业栽培。

**讨论总结与结论翻译：**
讨论部分指出，TIB系统（尤其是水平配置）通过增加光照、空间和气体交换，提高了芽体增殖率、干物质积累、气孔功能和叶绿素含量，从而增强了体外光混合营养（in vitro photomixotrophism）。TIB中的连续通气降低了相对湿度，促进了CO₂同化，改善了气孔功能，而半固体系统因高湿抑制了气孔功能。水平TIB因几何形状优化了光照，使叶片生长更佳。驯化阶段高存活率（98%）与叶绿素含量、气孔密度和闭合气孔百分比增加有关，这些变化有助于防止脱水。PET容器成本低（约63.57美元/4L单位），可回收，但不可高压灭菌，需用UV消毒。未来需研究微塑料释放。结论部分翻译如下：总之，研究结果表明，使用聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）制成的临时沉浸生物反应器（TIB）为香草（Vanilla planifolia）的商业化微繁殖提供了可行替代方案。与半固体系统相比，该系统提高了增殖率并改善了体外芽体质量，无需生根阶段，从而促进了离体驯化（ex vitro acclimatization）期间的更高存活率。