《Tissue Barriers》：Intestine organotypic culture recapitulates human embryonic villus morphogenesis at week 8
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人类小肠依赖绒毛生成营养吸收和屏障完整性所需的大吸收表面积。现有体外模型无法重现早期绒毛形态发生，因为它们缺乏驱动绒毛起始的发育信号和上皮-间质相互作用。这类模型对于理解人类绒毛形成机制以研究肠道发育和疾病至关重要。本研究旨在建立一种重现早期绒毛发育的人器官型
人类小肠依赖绒毛生成营养吸收和屏障完整性所需的大吸收表面积。现有体外模型无法重现早期绒毛形态发生，因为它们缺乏驱动绒毛起始的发育信号和上皮-间质相互作用。这类模型对于理解人类绒毛形成机制以研究肠道发育和疾病至关重要。本研究旨在建立一种重现早期绒毛发育的人器官型肠道模型，并将其特征与人类胚胎进行比较。将含有肠道干细胞和祖细胞群体的原代类器官来源上皮细胞，以及Caco-2/HT29共培养物（作为参考），分别培养在含有原代小肠基质细胞的水凝胶上（Transwell系统）。通过组织学、电子显微镜、跨上皮电阻（TEER）、通透性测定、基因表达分析、生长因子分泌以及与人类胚胎十二指肠（Carnegie分期20–23）的比较来评估模型。两种模型均形成极化的上皮单层，但与成熟体内肠道相比微绒毛稀疏。引人注目的是，仅类器官来源模型产生了基质细胞和细胞外基质（ECM）填充的上皮突起，并有局部层粘连蛋白沉积。该模型激活了关键发育通路（SHH、PDGF-AA、BMP4和WNT5A），上调了绒毛相关转录因子（FOXF1、FOXF2和FOXL1），并表达了与绒毛起始相关的层粘连蛋白亚型。突起的形态和高度（约28?μm）与Carnegie分期21胚胎的早期绒毛非常相似。
**研究背景与问题**
人类小肠依赖绒毛结构实现营养吸收和屏障功能，其表面面积通过绒毛的指状突起显著扩大。绒毛发育始于妊娠第6周（Carnegie分期CS16–17），至第8周（CS20–23）出现圆形突起。现有体外模型，如基于细胞系（Caco-2/HT29）的Transwell系统、微流控芯片及类器官培养，均存在局限性：细胞系模型缺乏绒毛；芯片模型依赖外部机械力而非发育信号；类器官缺少间质核心。因此，开发能重现早期绒毛形态发生（涉及上皮-间质相互作用和发育信号通路）的体外模型，对于研究肠道发育及相关疾病（如乳糜泻、短肠综合征）至关重要。
**研究内容与结论**
研究人员建立了一种人器官型肠道模型，将原代类器官来源的上皮细胞（含干细胞和祖细胞）或Caco-2/HT29共培养物（作为参考）接种于含有原代小肠基质细胞（来自成人十二指肠手术样本，三个独立供体）的胶原-纤维蛋白水凝胶上，在Transwell系统中培养。通过组织学、电镜、TEER、LY通透性、qPCR、生长因子检测及与人类胚胎（CS20–23，来自3D Atlas of Human Embryology）比较，评估模型。结论：仅类器官来源模型形成基质细胞和ECM填充的上皮突起，伴有局部层粘连蛋白沉积，激活SHH、PDGF-AA、BMP4、WNT5A通路，上调FOXF1、FOXF2、FOXL1转录因子，表达LAMA1–5层粘连蛋白亚型；突起高度（平均28?μm）与CS21胚胎十二指肠早期绒毛高度接近，形态相似。该研究首次在静态Transwell系统中通过内源性发育信号实现早期绒毛形态发生。论文发表在《Tissue Barriers》。
**主要关键技术方法**
1. 原代细胞分离与培养：通过EDTA螯合和胶原酶/分散酶消化从手术废弃十二指肠组织（阿姆斯特丹大学医学中心生物库，三个独立供体）分离上皮隐窝和基质细胞，分别培养为类器官（Intesticult培养基）和基质细胞（DMEM+1% Ultroser G）。
2. 模型构建：将基质细胞（第3代，>90% CD90+）包埋于胶原-纤维蛋白水凝胶中，置于Transwell插入物，表面涂覆GFR Matrigel?，再接种类器官来源单细胞或Caco-2/HT29共培养物（9:1）。
3. 表征手段：组织学与免疫荧光（H&E、IHC/IF）、扫描/透射电镜（SEM/TEM）、TEER测量、LY通透性、qPCR（WNT5A、BMP4、FOXF1/2、LAMA1–5等）、LegendPlex多因子检测（SHH、PDGF-AA、EGF、HGF等）及人胚胎十二指肠组织形态测量。
**研究结果**
*Characterization of isolated small intestinal cells used in the models*：通过流式细胞术分析，新鲜消化组织含约72% EpCAM+上皮细胞和28%基质细胞；螯合后培养的类器官（第3代）表达Ki-67和OLFM4（干细胞标志物）。基质细胞经培养至第3代后，CD90+细胞（成纤维细胞和肌成纤维细胞）占>90%，PDPN表达随传代增加，提示富集了PDPN+基质亚群。
*Organoid-derived model shows immature villus-like protrusions*：H&E、免疫组化（VIL、VIM）和IF（αSMA、PDPN）显示，类器官来源模型形成连续上皮层，并出现ECM填充的上皮突起，突起下方有VIM+、PDPN+及PDPN+/αSMA+基质细胞聚集；而细胞系模型仅形成平坦上皮。SEM/TEM显示两种模型均有微绒毛和糖萼，但较体内稀疏。TEER在类器官模型显著更高，LY通透性无差异。
*Key pathways of primary cluster development are activated in the organoid-derived model*：ELISA检测显示，SHH在两种模型均有分泌，但细胞系模型更高；PDGF-AA在类器官模型显著更高（apical和basal侧）。IF发现PTCH1在两种模型的上皮和间质均表达，但GLI1仅见于类器官模型。qPCR显示类器官模型中BMP4 mRNA显著高于细胞系模型，WNT5A也有升高趋势（不显著），且BMP4显著高于WNT5A。IF中BMP4在细胞系模型仅见于上皮，而在类器官模型见于上皮和间质。EGF、HGF和TGF-α在类器官模型分泌显著增加。
*Laminin is deposited under the epithelial protrusions*：qPCR显示类器官模型FOXF1显著上调，FOXF2和FOXL1有上调趋势。IF显示胶原IV在两种模型均呈薄基底膜样分布，而强层粘连蛋白染色仅见于类器官模型突起下方。qPCR检测到类器官模型表达LAMA1、LAMA2、LAMA3、LAMA4、LAMA5，细胞系模型未检测到。
*Height of protrusions in the organoid-derived model resembles early developing villi in human embryos*：与人类胚胎（CS20–23）十二指肠和空肠/回肠定量比较，类器官模型突起高度范围12–52?μm（平均28?μm），底宽约45?μm，间距约320?μm。胚胎绒毛高度随阶段增加：CS21十二指肠约小突起，CS22约60?μm，CS23约110?μm；空肠/回肠发育较晚。类器官模型突起高度最接近CS21十二指肠和CS22空肠/回肠，对应第8周早期绒毛。
**讨论与结论**
讨论部分指出，该模型通过激活SHH、PDGF-AA、BMP4、WNT5A等发育通路及局部层粘连蛋白沉积，重现了体内早期绒毛形态发生的关键特征。与细胞系模型相比，类器官来源的上皮-间质相互作用更动态，SHH信号转导更完整（GLI1表达），且BMP4在间质中表达，提示通路激活。突起高度与CS21胚胎相当，但间距较大，可能因平面几何和基质细胞密度限制。局限性包括基质细胞简化（富集CD90+亚群）和缺乏外周组织约束。结论：本研究建立了人肠道器官型模型，通过结合类器官来源上皮细胞与原代基质细胞水凝胶，模拟了早期胎儿样绒毛形成（ECM填充突起），为研究人类肠道发育、疾病建模及治疗筛选（如CRISPR/Cas编辑）提供了平台。
