靶向烟粉虱btCHS和btG6PI基因的纳米颗粒介导RNAi递送系统

《Insects》：Nanoparticle-Mediated RNAi Delivery System Targeting the btCHS and btG6PI Genes in Bemisia tabaci

　　

RNA干扰（RNAi）技术已成为开发生物农药的一种有前景的方法。然而，其在田间的有效性在很大程度上取决于开发能够将双链RNA（dsRNA）稳定递送到靶标的高效且稳定的系统。在本研究中，研究人员描述了一种基于纳米材料（C60/APG）的新型dsRNA递送系统，并通过靶向农业害虫烟粉虱（Bemisia tabaci）的几丁质合酶（btCHS）和葡萄糖-6-磷酸异构酶（btG6PI）基因，系统评估了其RNAi效率。结果显示，与单独使用dsRNA（存活率30%和40%）相比，dsCHS+Nano和dsG6PI+Nano组在处理后10天的存活率显著降低（约10%和25%），这是因为纳米载体递送的dsRNA被烟草植株吸收并触发针对靶标基因的RNAi，从而抑制了烟粉虱的发育。这些发现证实了纳米载体在提高RNAi效率中的作用，并支持开发可持续的纳米RNAi策略用于作物害虫防治。

**论文解读：纳米载体增强RNAi靶向烟粉虱btCHS和btG6PI基因的研究**

**一、研究背景与问题提出**

烟粉虱（*Bemisia tabaci*，半翅目：粉虱科）是一种全球性重要农业害虫，寄主范围超过900种植物，分布于100多个国家和地区，可传播多种植物病毒，严重影响作物生长与发育。当前化学农药防治面临抗药性、环境污染等问题，亟需开发环境友好型替代策略。RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术通过特异性沉默昆虫关键基因，提供了一种绿色防控手段，但其田间应用的关键瓶颈在于双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）的稳定性与递送效率。传统dsRNA易被环境降解，且难以穿透昆虫体壁、肠道围食膜等屏障。纳米技术为解决这一问题提供了新思路，纳米载体可保护dsRNA、增强其穿透能力，从而提高RNAi效率。在前期研究中，RNAi已用于烟粉虱控制，但dsRNA递送效率尤其是半翅目昆虫的低RNAi敏感性仍是主要挑战。本研究旨在开发一种基于C₆₀/烷基多葡萄糖苷（alkylpolyglucoside，APG）纳米材料的dsRNA递送系统，靶向烟粉虱几丁质合酶（btCHS）和葡萄糖-6-磷酸异构酶（btG6PI）基因，系统评估其RNAi效果，为可持续纳米RNAi策略提供依据。该论文发表在《Insects》期刊。

**二、主要关键技术方法**

研究人员从烟粉虱和烟草（*Nicotiana tabacum* cv. Zhongyan 100）样本中提取总RNA，克隆btCHS（557 bp）和btG6PI（541 bp）基因片段，体外合成dsRNA（使用T7 RNAi转录试剂盒）。将C₆₀纳米材料与dsRNA以质量比3:1融合，添加1% APG-0816形成纳米-dsRNA复合物。通过人工饲喂（10%蔗糖+1%牛血清白蛋白）、烟草根吸收（浸泡100 μL溶液）及叶面喷雾等途径处理烟粉虱成虫或若虫。采用RT-qPCR（2^-ΔΔCT法）检测靶基因表达，共聚焦显微镜（Zeiss LSM 980）观察Cy3标记dsRNA的分布，超景深显微镜（VHX-600E）测量若虫体长、体宽及发育历期，Log-rank检验分析生存曲线。样本来源：烟粉虱和烟草于人工温室（25±1°C，相对湿度70-80%，光周期16h:8h）饲养。

**三、研究结果**

**3.1 膜饲喂介导的btCHS和btG6PI沉默**
通过人工饲喂体外合成dsRNA 24小时后，RT-qPCR检测发现btCHS和btG6PI基因表达显著抑制，且10天内烟粉虱死亡率显著升高，表明dsRNA直接饲喂可有效沉默靶基因并导致致死效应。

**3.2 纳米介导dsRNA投递对btCHS和btG6PI表达的影响**
C₆₀/APG纳米颗粒（1500 ng/μL）对烟粉虱无毒性。将dsRNA（500 ng/μL）与纳米材料混合后通过烟草根吸收24小时，再让烟粉虱取食叶片24小时，结果显示：单独dsRNA处理使btCHS和btG6PI表达下降70%和60%，而纳米-dsRNA处理使表达下降90%，显著增强沉默效率。生存曲线显示，dsRNA+Nano组10天存活率约10-25%，显著低于单独dsRNA组（30-40%）。

**3.3 纳米颗粒携带dsRNA通过根吸收进入烟草植株**
Cy3标记的纳米-dsRNA通过根吸收后，共聚焦显微镜观察到叶片中荧光信号显著强于单独dsRNA，证明C₆₀/APG促进dsRNA长距离运输至叶组织。

**3.4 根吸收RNAi处理抑制烟粉虱生长**
靶向btCHS的RNAi处理后，各龄期若虫体宽和体长均减小，3龄若虫体宽减少约12.1%，体长减少约6.5%。靶向btG6PI的处理同样导致体长和体宽降低，3龄若虫体宽减少9.0%，体长减少6.5%。形态变化与生存曲线显示的致死效应一致，表明btCHS和btG6PI是烟粉虱生长关键基因，纳米载体加重了发育缺陷。

**3.5 根吸收dsRNA对烟粉虱发育历期的影响**
沉默btCHS后，1龄和2龄若虫发育历期显著延长；沉默btG6PI后，4龄若虫发育历期显著延长，说明靶基因沉默扰乱昆虫发育时序。

**四、讨论与结论**

讨论部分指出，C₆₀/APG纳米递送系统成功克服了dsRNA稳定性差和穿透力低的瓶颈，显著增强了RNAi效率，导致烟粉虱生长抑制和致死。纳米载体不仅保护dsRNA免受环境降解，还促进其通过植物维管束运输至叶片，提高昆虫摄取效率。研究结果与已有报道（如SPc纳米载体提高橘小实蝇dsRNA稳定性、星形聚阳离子载体递送ds-miRNA等）一致，共同证实纳米载体在RNAi应用中的关键作用。同时，研究人员对潜在脱靶效应进行了评估：通过NCBI BLAST序列比对选择烟粉虱种内高变区域，避免保守跨物种同源区；C₆₀/APG实验浓度无生物毒性；dsRNA环境降解快，无残留风险。因此，该控制系统对非靶标生物生态风险低且可控。

**研究结论**：总之，C₆₀/APG纳米材料与RNAi技术的结合可能为田间应用中dsRNA稳定性差和递送效率低的问题提供解决方案，并为促进农业可持续发展提供新的技术储备。在此基础上，未来的研究应探索不同纳米材料和靶基因的最佳组合，以获得理想的田间防治效果。