综述：空间组学技术在胶质母细胞瘤研究中的原理、应用与最佳实践

《Genes》：Spatial Omics Technologies in Glioblastoma Research: Principles, Applications, and Best Practices

　　

背景/目的：胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）仍然是成人中最具侵袭性的原发性脑肿瘤，其特征为不可避免的复发、广泛的肿瘤间和肿瘤内异质性以及对当前疗法的耐药性。GBM的一个决定性特征是恶性细胞与多样化肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）之间的动态相互作用，这些共同驱动疾病进展、治疗适应和复发。因此，理解这些复杂的细胞生态系统已成为胶质母细胞瘤研究的主要焦点。空间组学技术的最新进展极大地提升了研究人员在完整组织结构中直接研究GBM生物学的能力。在过去五年中，不断扩展的空间转录组学、蛋白质组学和多组学平台实现了对细胞状态、细胞-细胞相互作用和组织微环境的高维表征，同时保留了空间背景。这些方法为肿瘤组织、细胞可塑性、免疫微环境、血管微环境以及治疗诱导的生态系统重塑提供了前所未有的见解。方法：在本综述中，研究人员概述了迄今为止空间组学在胶质母细胞瘤研究中的应用。结果：研究人员总结了所采用的技术、分析的患者样本类型和数量，以及生成的主要生物学和临床见解。研究人员比较了不同空间平台的优缺点，讨论了研究设计和数据解释的关键考虑因素，并强调了多模态和纵向分析中的新兴趋势。结论：通过整合技术和生物学视角，本综述为希望在胶质母细胞瘤研究中实施空间组学方法并推进精准神经肿瘤学的研究人员提供了实用资源。

**1. 引言**
胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最具侵袭性的原发性脑肿瘤，尽管采用最大安全手术切除后联合放疗和替莫唑胺化疗的多模式强化治疗，复发几乎不可避免，总生存期极少超过2年。GBM的侵袭性临床行为及其有限且常为短暂的治疗反应主要归因于其深刻的肿瘤间和肿瘤内异质性，以及肿瘤细胞适应扰动的能力。重要的，GBM不再被视为同质肿瘤团块，而被认为是复杂的、空间组织的生态系统，由嵌入动态肿瘤微环境（TME）中的多样化恶性细胞群体组成。TME本身表现出显著的空间异质性，并组织成不同的细胞和结构微环境，这些微环境在细胞组成、代谢活性、血管结构、免疫浸润以及与周围脑实质的相互作用方面存在差异。这些微环境受局部环境因素如氧可用性、营养梯度和组织结构的影响，形成具有独特生物学特性的区域邻域。在此生态系统中，细胞-细胞和细胞-基质相互作用共同控制肿瘤生长、侵袭、免疫逃逸和治疗耐药，导致微环境在疾病进展和治疗过程中不断演变。因此，理解GBM需要超越纯粹的肿瘤细胞中心视角，并接纳空间组织和多细胞框架。然而，捕捉这些复杂的生态系统动态已被证明具有挑战性。传统的批量转录组学方法提供有价值的分子信息，但平均了数百万个细胞的信号，从而掩盖了区域异质性、微环境特异性生物学和局部治疗脆弱性。单细胞技术提供了细胞多样性和状态转换的前所未有的分辨率，但需要组织解离，导致空间背景以及控制完整组织中细胞行为的物理关系丧失。因此，这两种方法单独都无法完全解释细胞状态、微环境微环境和细胞-细胞相互作用如何协同驱动疾病进展。空间组学技术通过在高维分子分析的同时保留组织结构，成为解决这一挑战的有力工具。在本综述中，研究人员概述了已应用于胶质母细胞瘤研究的空间组学技术，考察了这些平台如何用于探究肿瘤生物学，如何选择和表征患者队列及组织标本，以及空间数据集与临床和分子信息的整合程度。该分析揭示了技术采用、队列设计、组织采样策略和生物学发现中的明确趋势。通过综合这些发展，研究人员确定了新兴的最佳实践，强调了当前局限性，并概述了未来机遇。

**2. 材料与方法**
于2026年2月进行文献检索，重点关注包含空间组学技术应用于胶质母细胞瘤患者样本的研究文章和综述论文。在Medline中进行在线文献检索，使用检索词：(1) '胶质母细胞瘤' + '空间转录组学'、(2) '胶质母细胞瘤' + '组学' 和 (3) '胶质母细胞瘤' + '单细胞空间技术'，发表时间限制在过去5年内。排除IDH野生型胶质母细胞瘤以外的肿瘤文章。研究人员进一步使用'相关文章'功能并纳入初始筛选中的参考文献来扩展检索。在准备本手稿期间，作者使用FigureLabs用于准备图形摘要。初始布局被矢量化，随后由作者手动精炼、标注和验证以确保科学准确性。

**3. 已发表空间组学队列的比较分析**
为了更好地表征胶质母细胞瘤中空间组学的当前格局，研究人员对整合了人胶质母细胞瘤标本空间分辨分子分析的重要研究进行了详细比较。研究人员提取了一套标准化的技术、生物学和临床参数，以评估该领域随时间如何演变，并识别未来研究的剩余机会。该比较框架允许采用不同技术和分析方法的研究在共同标准下进行评估，提供现有胶质母细胞瘤空间组学资源的优势和局限性概述。对于每项研究，研究人员记录了队列的临床组成，包括患者数量、是否包含新诊断和/或复发肿瘤，以及是否可获得匹配的纵向样本。这些参数决定了数据集能够捕获患者间异质性和治疗期间肿瘤演变的程度。研究人员还编录了每项研究中纳入的分子模态，包括基因组测序、DNA甲基化分析、单细胞转录组学、空间转录组学和多重免疫组化。由于每种模态探究肿瘤生物学的不同层面，该评估说明了从单一技术研究向能够关联遗传改变、转录可塑性、蛋白质表达和空间组织的综合多组学方法的日益转变。为了量化分子分析深度，研究人员提取了如分析的组织切片数量、分析的单个细胞数量、空间覆盖范围以及多重检测的维度等指标。这些参数反映了可重建肿瘤生态系统的分析分辨率，并决定了识别跨患者保守细胞状态和空间微环境的统计功效。最后，研究人员记录了补充临床和病理学注释的可用性，包括治疗史、MGMT甲基化状态、分子亚型、生存数据和其他临床病理学变量。此类元数据对于将描述性空间图谱转化为临床有意义资源至关重要，通过实现空间生态系统结构与患者结局或治疗反应之间的关联。总之，这些参数捕捉了现代胶质母细胞瘤空间组学研究的三个决定性维度：临床广度、分子深度和多模态整合。跨这些维度比较已发表队列不仅揭示了在过去十年中取得的显著技术进步，也揭示了必须解决的持续挑战，以生成能够支持生物学发现、生物标志物开发和精准肿瘤学的参考图谱。

**4. 胶质母细胞瘤中单细胞和空间组学的演变**
尽管空间组学技术最近才应用于GBM，但多项研究在平台、队列组成、分析方法和分子模态存在显著差异的情况下，仍出现了几个显著一致的主题。这一概念框架的基础是通过单细胞转录组学研究建立的，这些研究从根本上重塑了对GBM异质性的理解。具有里程碑意义的分析表明，恶性细胞并非随机异质，而是占据多个转录状态，这些状态再现了正常脑的发育层级。初始研究确定了四种主要细胞程序（即神经祖细胞样（NPC-like）、少突胶质细胞祖细胞样（OPC-like）、星形胶质细胞样（AC-like）和间充质样（MES-like）状态），并随后在众多独立队列和实验平台中得到了验证。重要的，这些程序并不代表固定的细胞身份，而是动态且可逆的状态，可以共存于同一肿瘤内，甚至存在于单个遗传克隆内。最近，该框架通过识别额外群体（包括胶质祖细胞样（GPC-like）、神经元样（NL-like）和纤毛样（CL-like）细胞）得到了扩展，揭示了原始四状态模型代表了更连续细胞身份景观的简化视图。总之，这些研究确立了细胞可塑性作为GBM生物学的决定性特征，并挑战了离散分子亚型的传统概念。尽管取得了这些进展，单细胞方法仅提供了肿瘤组织的部分视图。虽然它们成功识别了GBM生态系统的细胞成分，但无法确定这些群体在完整组织中的位置或它们如何相互作用。因此，空间转录组和蛋白质组技术的引入代表了一个关键的概念进步，使研究人员能够超越细胞清单，开始重建胶质母细胞瘤的生态组织。此外，随着空间组学技术向更高分辨率发展并同时捕获逐渐增多的生物分子（从一种到数千种），生物学见解的深度和粒度也相应增加。早期研究主要依赖于基于感兴趣区域（ROI）的方法，如GeoMx数字空间分析，能够比较预定肿瘤区室，但提供关于细胞-细胞相互作用的信息有限。空间转录组平台如Visium的引入随后能够在更大组织切片上进行转录组范围分析，但分辨率较低（平均每个斑点10-20个细胞），使研究人员能够重建区域生态系统模式并识别空间受限的信号程序。随后，单细胞和亚细胞分辨率技术，包括Xenium、CosMx、基于MERFISH的平台以及多重免疫荧光方法（MILAN、CycIF等），进一步改变了该领域。尽管最初仅能捕获较少数量的标记物（10-100个），这些方法已将焦点从区域生物学转向直接研究细胞邻域和物理相互作用。研究人员现在不仅可以确定哪些细胞类型在肿瘤内共存，还可以确定哪些细胞彼此相邻，以及这些相互作用在疾病进展或治疗期间如何变化。转录组技术的进一步进展现在能够在单细胞和亚细胞分辨率下进行接近全转录组的测量，而多重蛋白质组平台已从少量标记物扩展到在完整组织切片内同时检测数百种蛋白质。重要的，最重要的概念进步可能不仅仅是分子深度的增加，而是能够在单一空间框架内整合多种模态。早期多模态研究通常依赖于在相邻组织切片上进行的测量，需要计算对齐来推断分子层之间的关系。相比之下，新兴的空间多组学技术现在允许在同一组织切片内和同一单个细胞内同时定量多种生物模态，包括RNA、蛋白质、染色质可及性、基因组改变和细胞形态。这一转变通过直接整合互补分子信息而无需引入连续切片间组织异质性带来的不确定性，从根本上改变了空间生物学的范围。

**5. 胶质母细胞瘤中具有里程碑意义的空间组学发现**
虽然技术创新推动了空间组学的快速扩展，但这些方法的真正影响在于它们产生的生物学见解。在过去几年中，空间分析从根本上改变了我们对胶质母细胞瘤组织的理解，揭示肿瘤由反复出现的生态系统结构组成，而非随机分布的细胞群体。这些研究共同表明，空间背景是肿瘤行为、治疗反应和临床结局的主要决定因素。空间组学不仅识别了单个细胞类型，还使研究人员能够理解恶性、免疫、血管和神经群体如何在不同的微环境微环境中相互作用。在独立研究和技术中出现了几个反复出现的生物学主题，表明尽管存在显著的患者间异质性，常见的组织原则构成了胶质母细胞瘤进展的基础。

**5.1. 恶性细胞状态的空间组织**
虽然单细胞分析识别了大量细胞状态，但其空间组织在很大程度上仍未解决。通过空间组学分析，研究人员发现发育性肿瘤状态并非随机分布在肿瘤中，而是优先定位于特定的微环境微环境。OPC样和NPC样群体常驻留在血管周围区域，其特征是营养可用性增加和血管支持增强，而MES样群体则富集于缺氧、炎症和免疫丰富区域。AC样状态通常占据中间区域，可能代表对局部环境条件的适应性反应。重要的，空间分析表明，这些状态之间的转换受到局部微环境信号的强烈影响。发育程序似乎高度可塑，并对缺氧、炎症、代谢应激和治疗干预做出反应，而非代表稳定的细胞身份。这一观察将领域从静态分类系统转向动态生态系统模型，其中恶性细胞状态持续与其周围微环境相互作用。大规模整合工作如GBmap进一步证明，发育状态组织成反复出现的空间生态系统，这些生态系统在患者间是保守的。尽管存在深刻的基因组异质性，但这些生态系统结构反复出现，表明共同的环境约束塑造了胶质母细胞瘤的结构。

**5.2. 血管周围生态系统和干细胞微环境**
胶质母细胞瘤中最一致观察到的空间结构之一是血管周围微环境。历史上，这些区域被认为是胶质瘤干细胞样细胞的储存库，但空间组学显著细化了对某复杂性和功能重要性的理解。空间转录组学研究表明，血管周围区域包含独特的OPC样和NPC样恶性细胞群体，富集了与干性相关的转录程序。这些细胞常表现出发育调节因子、生长因子受体以及自我更新和治疗耐药相关信号通路的表达升高。血管区室本身远非被动。内皮细胞通过涉及血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）和Notch的信号通路与邻近恶性群体主动交流。这些相互作用有助于维持干细胞样状态，并可能促进对治疗压力的适应。Ren及其同事最近的工作识别了在胶质母细胞瘤和弥漫性中线胶质瘤中优先定位于特定血管微环境内的放射状胶质干细胞样群体。功能研究表明，这些微环境相关群体具有独特的脆弱性，可能为治疗干预提供机会。重要的，并非所有血管微环境在生物学上等效。新兴证据表明血管周围区域存在显著异质性，一些区域支持高度增殖的干细胞样群体，而其他区域则表现出增加的免疫浸润或血管重塑。未来研究可能进一步将这些生态系统细分为具有不同预后意义的功能亚型。

**5.3. 缺氧和坏死微环境作为肿瘤演变的引擎**
缺氧长期以来被认为是胶质母细胞瘤病理学的标志。然而，空间组学技术揭示了缺氧区域不仅仅是血管化不足的被动后果，而是肿瘤生态系统结构的主动组织者。空间转录组学分析一致显示MES样恶性群体在缺氧和坏死周围区域富集。这些细胞表现出HIF依赖性通路的激活、代谢重编程、细胞外基质重塑和炎症信号网络。缺氧也深刻影响非恶性群体，包括巨噬细胞、内皮细胞和反应性星形胶质细胞。Ravi等人的里程碑式研究证明，环境应激的肿瘤区域经历涉及恶性和非恶性细胞群体的协调转录适应。这些发现确立了缺氧是肿瘤-宿主相互依赖性的核心驱动因素，而不仅仅是代谢应激源，这一观点随后被Greenwald等人证实。最近，GBmap识别了多个与不良临床结局密切相关的缺氧相关生态系统。有趣的是，高度组织的缺氧微环境似乎比单独缺氧相关基因表达具有更大的预后意义，表明空间结构本身可能携带生物学和临床信息。缺氧微环境也是免疫抑制的主要中心。空间分析一致显示在这些区域内免疫抑制性巨噬细胞群体富集、抗原呈递途径改变以及细胞毒性淋巴细胞浸润减少。总之，这些观察将缺氧生态系统定位为肿瘤进展、免疫逃逸和治疗耐药的主要驱动因素。

**5.4. 侵袭性和神经元相关微环境**
胶质母细胞瘤最大的临床挑战之一是其向周围脑组织的弥漫性浸润。尽管进行了积极的手术切除，浸润性肿瘤细胞仍残留并最终驱动复发。历史上，由于这些群体丰度低且与正常脑组织紧密交织，难以研究。空间组学技术为侵袭性肿瘤区域的生物学提供了前所未有的见解。检查肿瘤-脑界面的研究一致表明，浸润性恶性细胞与位于肿瘤核心内的细胞存在显著差异。这些群体表现出发育基因、神经元相互作用通路、突触信号成分以及迁移和可塑性相关程序的表达增加。Harwood及其同事最近证明，浸润性胶质母细胞瘤细胞在侵入的脑组织内表现出Notch信号成分和突触相互作用基因表达增强。这些发现支持了恶性细胞主动利用神经元信号网络以促进侵袭和生存的日益增长的概念。一个相关的突破是识别了oncostreams，即由排列整齐的纺锤形细胞组成的高度组织的多细胞束，表现出间充质特征。Comba及其同事的空间分析表明，oncostreams作为动态迁移高速公路，能够协调整个肿瘤中的集体细胞运动。COL1A1作为oncostream组织关键调节因子的识别进一步表明，空间组织的侵袭程序可能具有治疗靶向性。总之，这些研究表明，侵袭不仅仅是单个细胞的特性，而是一个生态系统层面的现象，涉及恶性细胞、神经元、神经胶质细胞、细胞外基质成分和血管结构之间的协调相互作用。

**5.5. 免疫微环境的空间结构**
也许空间组学对胶质母细胞瘤生物学的任何方面的影响都不及对免疫微环境理解的深刻转变。传统模型常将巨噬细胞分类为M1或M2极化群体。然而，单细胞和空间分析揭示了一个远为复杂的现实。胶质母细胞瘤相关巨噬细胞作为多个转录和空间上不同的群体存在，包括SPP1⁺、TREM2⁺、APOC1⁺、FOLR2⁺和MARCO相关状态，每种状态均表现出独特的分布和功能特征。高维成像研究表明，免疫细胞组织成不同的空间邻域，而非随机分散在整个肿瘤中。某些巨噬细胞群体优先定位于缺氧区域，而其他群体则聚集在血管周围或侵袭前沿。这些空间分布强烈影响局部细胞因子信号传导、抗原呈递和免疫抑制。Karimi及其同事生成了首个跨原发性和转移性脑肿瘤的免疫结构综合图谱，揭示免疫生态系统组织在不同肿瘤类型间存在显著差异。后续研究识别了与有利或不利临床结局相关的特定免疫邻域，突出了空间免疫结构的潜在预后意义。空间蛋白质组学研究进一步证明，T细胞排除在胶质母细胞瘤中并非均匀分布。相反，淋巴细胞常积聚在受限的微解剖区室和血管周围，而被排除在肿瘤实质的大部分区域之外。理解这些排除模式背后的机制可能对改善胶质母细胞瘤的免疫治疗反应至关重要。

**5.6. 治疗诱导的生态系统重塑**
空间组学研究中出现的最新主要见解是，疗法重塑了整个生态系统，而不仅仅是选择耐药肿瘤克隆。配对原发性和复发性胶质母细胞瘤的纵向分析表明，复发常伴随细胞组成、空间组织、免疫结构和微环境信号的显著改变。虽然遗传进化确实有助于疾病进展，但许多最显著的变化发生在生态系统层面。Wang及其同事证明，复发性肿瘤常表现出增加的间充质极化，伴随周围免疫群体的广泛重塑。最近配对的原始-复发空间分析进一步表明，不同患者间可能存在不同的进化轨迹。一些肿瘤进展为高度炎症的间充质生态系统，特征为深刻的免疫抑制，而其他肿瘤则发展为更血管化和免疫活性较高的微环境，与改善的临床结局相关。这些发现提出了生态系统进化可能成为基因组标志物（MGMT、TERT、EGFR）的附加价值的可能性，而后者是当前胶质母细胞瘤患者分层的标准。目前，空间组学的临床应用受到高成本、长周转时间和计算/生物信息学限制的阻碍。总之，纵向空间研究强调了胶质母细胞瘤生态系统的动态性质，并强调了未来研究需要超越单时间点分析，转向在整个疾病进展和治疗过程中进行全面的生态系统追踪。

**6. 队列设计和组织选择塑造生物学发现**
空间组学技术的演变伴随着用于研究胶质母细胞瘤的患者队列和组织资源的并行转变。早期研究主要是在相对较小队列（<15个样本）上进行的概念验证研究，主要目标是展示新兴空间分析平台的可行性。随着技术成熟和更易获得，通过多中心合作、机构生物样本库以及整合公开可用数据集，队列规模逐渐扩大。这一进展使得从高度聚焦的探索性研究转向涉及数十至数百名患者的日益全面的分析。与此同时，患者队列的组成也发生了显著演变。初始研究主要检查未经治疗的新诊断胶质母细胞瘤样本，反映了手术标本的可获得性以及早期对定义基线肿瘤结构的强调。最近的研究越来越多地纳入复发性疾病，认识到耐药性肿瘤代表了疾病进展的临床最重要阶段。几项具有里程碑意义的研究现在分析了来自同一患者的配对原发性和复发性肿瘤，从而能够直接研究疾病演变和治疗干预期间的生态系统重塑。这些纵向队列设计为胶质母细胞瘤生物学的动态性质提供了独特见解，并开始揭示恶性、免疫和基质群体如何适应治疗过程。空间研究规模的增加也伴随着临床注释的日益丰富。虽然早期研究常常主要关注生物学发现，但最近的研究整合了详细的临床信息，包括治疗史、生存结局、分子生物标志物、放射学特征和病理学特征。特别地，纳入MGMT启动子甲基化状态、切除范围和纵向结局数据促进了空间生态系统组织与患者预后之间关联的探索，尽管此类信息通常未纳入分析。因此，空间分析与临床元数据的整合已成为当代胶质母细胞瘤研究中日益重要的组成部分。可用于空间分析的生物材料也显著多样化。新鲜冷冻标本最初构成了许多转录组学研究的基础，因为它们对核酸保存极佳，且与全基因组测序方法包括单细胞和空间转录组学兼容。这些样本使得能够生成首批胶质母细胞瘤高分辨率分子图谱，并为肿瘤细胞状态和微环境相互作用提供了前所未有的见解。同时，检测方法开发的进展逐渐扩大了可在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织上进行的空间分析范围。鉴于FFPE材料代表了全球存档临床标本的主要形式，这一发展使研究人员能够访问与长期临床随访相关联的广泛回顾性队列。因此，转录组学和蛋白质组学技术与FFPE组织日益增加的兼容性极大地拓宽了空间胶质母细胞瘤研究的范围。伴随这些发展，空间研究采用了多种组织采样策略。全组织切片已被广泛用于保留胶质母细胞瘤的结构复杂性，能够可视化跨越肿瘤核心、浸润边缘、血管微环境和坏死区域的空间梯度。这些方法对于揭示肿瘤生态系统中恶性和非恶性细胞群体的空间组织至关重要。同时，组织微阵列（TMA）的构建通过允许同时分析数百个组织核心，促进了日益庞大患者队列的分析。总之，全切片分析和基于TMA的研究为胶质母细胞瘤生物学提供了互补视角，平衡了详细空间背景与大规模人群水平调查。集体而言，这些发展改变了空间胶质母细胞瘤研究的格局。该领域已从在有限数量新鲜冷冻标本上进行的小型探索性研究，进展为大规模、临床注释的队列，包含新诊断和复发性疾病，并使用多种空间转录组、蛋白质组和多组学技术进行分析。队列规模、临床深度和组织可及性的这种扩展为更全面调查胶质母细胞瘤的生态组织和进化动态奠定了基础。

**7. 当前研究的持续局限性**
尽管空间组学技术取得了显著进展，但几个重要限制继续制约其在胶质母细胞瘤研究中的转化影响。最突出的挑战之一是大多数空间队列的规模有限。大多数发现研究仅分析少数肿瘤（每个平台<15个样本），这限制了统计功效并限制了报告结果的普适性。即使是较大的图谱研究也常常分析可用样本的选定子集，而非真正代表性队列，引入了选择偏倚风险。第二个限制是复发性疾病的持续代表性不足。尽管复发是导致几乎所有胶质母细胞瘤相关死亡率的临床相关阶段，但相对较少的空间研究包括复发性肿瘤，且仅少数研究调查了配对原发-复发对。空间分析固有的静态性质无法捕获时间动态。因此，区分预先存在的空间异质性与治疗诱导的适应仍然困难，使得肿瘤生态系统在治疗期间的进化轨迹未被完全理解。采样偏倚代表了另一个挑战。大多数研究优先分析具有高细胞密度和最佳组织质量的可行肿瘤区域，而浸润边缘、缺氧和坏死过渡区、血管周围微环境以及邻近脑组织常被低估。鉴于这些区室之间存在显著生物学差异，此类采样策略可能提供不完整的肿瘤生态系统视图，即使可能存在技术障碍来可靠地调查质量通常较差的坏死区域。在分子水平上，通过在靶向空间转录组和蛋白质组方法中使用预定义基因或蛋白质面板，也可引入类似偏倚。尽管这些靶向方法产生了重要的生物学见解，但可能忽略意外的细胞程序和信号通路。同样，基于组织微阵列的研究虽然能够实现成本效益的大规模筛选，但牺牲了构成空间生物学基础的大量区域结构信息。技术和分析异质性进一步使该领域复杂化。在组织处理程序、样本质量控制、分割策略、细胞类型注释方法、邻域定义和空间统计框架方面存在显著差异。一些平台空间分辨率较粗，常导致邻近细胞信号混合。适当的细胞分割不幸仍然是脑组织分析特有的关键技术缺陷，使得标准基于细胞核的分割算法通常质量不足。因此，多个分子的信号被映射到空间斑点、箱或像素上，固有地排除了单分子分析。此外，空间或物理邻近性本身不一定意味着功能性细胞-细胞相互作用。因此，在得出结论真正的细胞-细胞通讯之前，空间信息应与配体-受体表达和额外功能测试（例如，使用邻近连接的直接细胞-细胞相互作用）整合。此外，关键技术参数的报告，包括失败样本、ROI选择标准和预处理工作流程，在研究中仍不一致。总之，这些因素阻碍了可重复性，限制了跨研究比较，并使进行稳健的荟萃分析复杂化。外部验证队列对于证明在独立患者群体中的普适性和降低过拟合风险至关重要，但尽管其重要性得到认可，仍不常见。也许最重要的是，许多空间组学研究仍仅与临床和机制研究松散关联。临床注释常常不完整，治疗方案和治疗反应、MGMT甲基化状态、切除范围、肿瘤位置、放射学特征和长期结局的报告不一致。空间组学技术中观察到的异质性可能不仅捕获并说明潜在的固有生物学，还可能易受治疗相关混杂因素的影响，强调了治疗效果与固有肿瘤生物学之间的纠缠。因此，相对较少的研究能够将空间生态系统特征直接与临床可操作的患者分层策略联系起来。迄今为止，尽管已识别了许多候选细胞状态、微环境和相互作用网络，但尚无空间生物标志物进入胶质母细胞瘤的常规临床决策。此外，通过空间分析识别的许多生物学关联尚未经过充分的功能验证以确立因果关系或治疗相关性。因此，当前空间组学发现的相当大比例仍然是描述性的，而非机制性解析。最后，尽管空间多组学正在迅速兴起，但转录组、蛋白质组、基因组、表观基因组、成像和临床数据的全面整合仍然相对不常见。大多数研究继续孤立地检查单个分子层，限制了重建控制肿瘤进展和治疗反应的复杂调控网络的能力。因此，未来进展不仅取决于生成日益详细的时空数据集，还取决于将这些数据与功能实验模型、纵向患者队列和深度注释的临床数据集整合。这些努力对于将空间发现从描述性生态系统图谱转化为生物学验证和临床可操作的治疗策略至关重要。

**8. 最佳实践和迈向胶质母细胞瘤标准化空间组学的路线图**
为了加速临床转化，胶质母细胞瘤研究界应超越单个概念验证研究，采用协调的实验、计算和报告框架。与其从头制定新标准，许多建议可以建立在更广泛空间组学和单细胞社区已建立的成功倡议基础上。通过共识协议标准化组织采样：空间异质性是GBM的定义特征之一，但采样策略在研究间差异显著。一个国际工作组可以建立共识建议，定义最低采样框架，包括收集肿瘤核心、浸润边缘、坏死区域，并在可行的情况下收集配对原发和复发标本。此类协调的采样方法已由GBM-Space联盟实施，该联盟在多个肿瘤区域进行系统性多区域采样，结合匹配的单细胞和空间分析。创建社区参考数据集：类似于人类细胞图谱和HuBMAP倡议，GBM领域将受益于一个公开可访问的参考图谱，包含跨多个机构生成的标准化的空间转录组、空间蛋白质组、组织病理学、基因组和临床数据集。这些数据集应包括恶性细胞状态、免疫群体、血管微环境和治疗状态的专家策划注释，允许新技术和计算方法根据共同参考标准进行基准测试。大型图谱倡议已表明统一的处理流程、集中式质量控制和交互式公共数据门户显著提高了可重复性和数据再利用。开发基准测试的生物信息学流程：社区应建立模块化参考流程，涵盖质量控制、图像配准、细胞分割、归一化、批次校正、细胞类型注释、空间域识别、邻域分析、配体-受体推断和多模态整合，而不是依赖实验室特定的工作流程。这些工作流程应通过GitHub公开提供，作为容器化的Docker或Singularity环境分发，并进行版本控制以确保计算可重复性。类似于SpaceTx联盟发起的基准测试工作可用于GBM，允许使用相同参考数据集客观比较不同计算方法。建立标准化报告指南：该领域将受益于类似于微阵列MIAME或人类细胞图谱制定的报告标准的报告框架。一个符合常见实践的空间组学实验最低信息（MISOE）指南可以定义发表所需的最低元数据，包括患者人口统计学、分子亚型、治疗史、采样策略、技术平台、质量控制指标、计算方法、软件版本以及原始和处理后数据在公开可访问存储库中的存放。此类标准化元数据将极大地促进可重复性、跨研究比较和未来荟萃分析。促进多模态和跨平台验证：生物学发现不应仅依赖单一空间技术。通过全转录组空间分析识别的候选生物标志物应常规使用正交方法进行验证，包括多重免疫组化、RNAscope或基于靶向成像的空间转录组学，并在独立患者队列中再现。日益增加的整合空间图谱证明了结合基于测序的空间转录组学与基于成像的方法和单细胞数据集以产生更稳健生物学见解的价值。从一开始就设计用于临床实施的研究：发现研究应纳入预定义的验证策略，并明确定义通向临床可部署检测的转化途径。未来努力应优先考虑将高维特征简化为稳健的生物标志物面板，这些面板可使用与常规病理实验室兼容的技术实施，而不是仅仅关注日益复杂的分子图谱。前瞻性多中心验证、与监管机构早期接触以及与行业合作伙伴的合作应成为研究设计的组成部分，而非下游考虑。总体而言，这些建议为下一代胶质母细胞瘤空间组学研究提供了现实路线图。该领域已证明胶质母细胞瘤组织成可重复的空间生态系统，并且治疗适应在很大程度上反映了生态系统重塑而非纯粹的遗传进化。因此，下一个挑战是建立研究设计、计算分析、数据共享和生物标志物验证的共同标准。通过利用由人类细胞图谱、HuBMAP、SpaceTx和GBM-Space等倡议建立的成熟框架，GBM社区可以加速开发可重复的空间生物标志物，这些生物标志物最终适用于前瞻性临床试验和精准神经肿瘤学。