低强度聚焦超声以超声剂量和年龄为函数在体内改变阿尔茨海默病病理

《Brain Sciences》：Low-Intensity Focused Ultrasound Alters Alzheimer’s Disease Pathology, In Vivo, as a Function of Ultrasound Dose and Age

　　

背景/目标：阿尔茨海默病（AD）和血管性痴呆在尸检中占痴呆病例的约75%。AD部分源于异常蛋白（淀粉样蛋白β（Aβ）和Tau）的积累；血管性痴呆由脑血流量减少引起。每种痴呆机制都会损伤大脑。Bobola等人发现，其低强度聚焦超声（FUS）方案应用于5XFAD AD小鼠模型的大脑，通过激活小胶质细胞使Aβ减少50%。Eguchi等人发现，其自身FUS方案应用于相同小鼠模型，通过增加内皮型一氧化氮合酶（eNOS）使Aβ减少15%并增加脑血流量50%。在此，研究人员试图测试这两种FUS方案的组合版本，预期同时降低Aβ负荷和增加eNOS。方法：使用诊断超声探头，将组合FUS方案主要应用于麻醉的5XFAD小鼠左侧海马，每天一小时，年轻小鼠持续三天，老年小鼠持续五天。在第三天或第五天，分别收集大脑并进行组织学分析，评估Aβ负荷、小胶质细胞活化及其与Aβ的共定位，以及神经元核内eNOS（此处称为神经元内eNOS）和神经元外eNOS的负荷。结果：与未治疗小鼠相比，治疗的年轻小鼠有更多活化的小胶质细胞与Aβ共定位，大斑块的Aβ负荷降低，而eNOS各指标无变化。相比之下，治疗的老年AD小鼠中活化的小胶质细胞与Aβ共定位无变化，Aβ负荷也无变化。然而，与未治疗的老年AD小鼠相比，FUS降低了总eNOS和神经元外eNOS，并增加了神经元内eNOS。结论：FUS方案降低Aβ负荷和改变eNOS分布的能力关键取决于AD小鼠的年龄（老年小鼠相对于年轻小鼠，小胶质细胞数量相当但Aβ斑块更多）和治疗持续时间。在老年AD小鼠中观察到的FUS引起的神经元外eNOS分布减少引发了对该方案可能增加缺血的担忧，而神经元内eNOS的增加可能通过保护突触功能来抵消这一效应。这些发现还为FUS治疗方案确定了两个候选治疗窗口，每个窗口在转化到人类之前都需要更多研究。一个窗口是早期干预，通过激活小胶质细胞最大化Aβ斑块清除。第二个窗口是后期干预，如果可能减轻FUS对eNOS的差异效应引起的潜在缺血风险，则保护突触功能。

低强度聚焦超声以超声剂量和年龄为函数在体内改变阿尔茨海默病病理：一项论文解读

**研究背景**
痴呆症是一类破坏性神经退行性疾病，给个人和社会带来巨大负担。阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）和血管性痴呆（vascular dementia）在尸检中占痴呆病例的约75%。AD部分源于异常蛋白（淀粉样蛋白β（amyloid beta, Aβ）和Tau）的积累形成斑块和缠结，而血管性痴呆由脑血流量减少引起缺血性损伤。目前批准的药物（如Donanemab和Lecanemab）通过降低Aβ斑块负荷对认知衰退速度有温和影响。非药物治疗方法，如40 Hz光刺激或聚焦超声（focused ultrasound, FUS），展现出减少Aβ斑块的潜力。Bobola等人发现其FUS方案（无微泡）通过激活小胶质细胞使5XFAD小鼠Aβ斑块减少约50%；Eguchi等人使用不同FUS方案通过增加内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase, eNOS）使Aβ减少15%并提高脑血流量50%。然而，这两种方案分别针对不同机制，且尚未有研究将两者结合以协同作用。此外，年龄和疾病阶段可能影响FUS疗效，但此前研究多集中于年轻小鼠。因此，研究人员构造了一种结合两种时间模式的FUS方案，旨在同时激活小胶质细胞和增加eNOS，并探索小鼠年龄和治疗时长对效果的影响。该研究发表于《Brain Sciences》。

**主要技术方法**
研究人员使用诊断超声探头（Verasonics V-1系统，P42探头）对5XFAD小鼠（C57BL/6背景，雌性）进行经颅聚焦超声（FUS）处理。小鼠分为两组：年轻组（中位年龄7.5个月）接受3天治疗，老年组（中位年龄12.17个月）接受5天治疗，每天1小时。FUS方案结合了Bobola等人（40 Hz脉冲，5 ms持续时间）和Eguchi等人（6 kHz精细脉冲）的时序模式，载波频率2 MHz，空间峰值脉冲平均强度（Isppa）为90 W/cm2。治疗后，收集大脑左半球（接受更强FUS）进行组织学分析，包括Aβ斑块（抗β-淀粉样蛋白1-42抗体）、小胶质细胞（抗Iba1抗体）、eNOS（抗磷酸化eNOS抗体）的免疫荧光或DAB染色，以及核染色（DAPI或Eosin）。使用FIJI软件进行图像分析，通过Otsu二值化、颗粒分析器识别活化小胶质细胞（圆度≥0.523）和Aβ斑块共定位（距离≤0.15 μm），并计算eNOS在神经元核内外的分布（通过核形态和圆度区分）。样本来自美国杰克逊实验室，每组3只小鼠，每只小鼠取两张切片。

**研究结果**

**3.1 组织病理学和ECoG结果**
- 在3天年轻组和5天老年组中，均观察到活化小胶质细胞与Aβ斑块的共定位，以及eNOS在神经元核内外的分布。
- 脑电图（ECoG）测量显示，FUS在左侧海马诱导了40 Hz脑活动，验证了FUS激活神经活动的能力（与Bobola等人一致）。

**3.2 Aβ斑块和eNOS负荷分析**

**3.2.1 年轻AD小鼠（3天FUS治疗）**
- 通过分位数-分位数图（QQ plot）发现，Aβ斑块面积大于1800 μm2时存在差异。
- FUS治疗显著增加了与活化小胶质细胞共定位的Aβ斑块比例（FUS组60.07% vs 假手术组52.16%，p=0.034）。
- 总Aβ斑块面积百分比呈降低趋势（6.10% vs 11.25%，p=0.10），但大斑块（>1800 μm2）面积显著减少（1.19% vs 3.88%，p=0.045），小斑块（<1800 μm2）无显著变化（p=0.18）。
- eNOS总分布、神经元内和神经元外eNOS均无显著变化（p>0.05）。

**3.2.2 老年AD小鼠（5天FUS治疗）**
- QQ图提示Aβ斑块面积在3000 μm2和7000 μm2处可能存在差异，但后续分析未发现显著变化。
- 活化小胶质细胞与Aβ共定位比例无差异（FUS组18.19% vs 假手术组18.22%，p=0.86）。
- 总Aβ斑块面积、大斑块（>3000 μm2和>7000 μm2）面积均无显著变化（p>0.78）。
- 然而，FUS显著降低了总eNOS面积（6.73% vs 10.14%，p=5e-4）和神经元外eNOS（3.94% vs 8.04%，p=0.001），同时显著增加了神经元内eNOS（2.82% vs 2.38%，p=0.03）。

**讨论与结论**
讨论部分指出，FUS疗效依赖于小鼠年龄和治疗时长。年轻小鼠中，FUS通过激活小胶质细胞有效减少了Aβ大斑块，但老年小鼠因Aβ负荷更高（约2倍）且小胶质细胞数量相当，且存在免疫衰老，导致FUS无法激活足够的小胶质细胞清除斑块。eNOS方面，老年小鼠未经治疗时总eNOS和神经元内eNOS比例更高，FUS治疗减少了神经元外eNOS（可能降低脑血流量，增加缺血风险），但增加了神经元内eNOS（可能通过保护突触功能对抗缺血，参考Li等人研究）。这些发现识别了两个治疗窗口：早期干预（通过小胶质细胞清除Aβ）和晚期干预（保护突触功能，需减轻缺血风险）。研究局限性包括样本量小（n=3）、FUS强度仅为Bobola等人研究的一半、未区分实质性与血管性Aβ、仅使用雌性小鼠等。未来需更大样本和更长时间治疗。

**结论翻译**：纯阿尔茨海默病、血管性痴呆及其组合占大多数痴呆病例。AD部分源于异常蛋白（Aβ、Tau）的积累及相关损伤；血管性痴呆由脑血流量减少引起，导致缺血性损伤。我们的结果表明，作为年龄函数的Aβ斑块总数巨大差异，加上可用小胶质细胞的微不足道差异，在FUS激活后者以帮助清除前者的能力中起重要作用。因此，在未来工作的支持下，我们的FUS方案有朝一日可能在减少痴呆患者Aβ早期积累方面具有价值。我们的结果还表明，FUS可以操纵神经元内和神经元外过程——此处为eNOS分布——具有迄今未知的抵消效应：可能的突触保护与可能的脑血流量减少（即缺血）之间的平衡。未来研究应解决这些差异效应，并评估FUS对血管性Aβ负荷的可能影响。如果成功，此类研究有朝一日可能将FUS方案确定为血管性或混合性痴呆后期的一种有前景疗法。