通过PBS可提取组分的拉曼光谱对食用和饲料昆虫进行物种鉴别

《Processes》：Species Discrimination of Edible and Feed Insects via Raman Spectroscopy of PBS-Extractable Components

　　

以昆虫为基础的食品和饲料成分市场不断增长，引发了关于真实性、标签透明度和法规合规性的担忧，凸显了对能够区分选定昆虫源材料的快速筛查方法的需求。在这项初步可行性研究中，研究人员评估了拉曼光谱（Raman spectroscopy）结合偏最小二乘判别分析（PLS-DA）对九种昆虫物种的PBS可提取组分进行指纹图谱识别和区分的性能。对96个干燥昆虫样品在磷酸盐缓冲液（PBS，pH 9.4）中制备的提取物进行了分析，经过质量控制后获得358个昆虫光谱；PBS光谱作为技术对照类别被纳入。总体正确分类率（CCR）达到61.6%，表明分类性能中等，而非经过验证的物种级别认证。西方蜜蜂（Apis mellifera）雄蜂的CCR达到100.0%，而黑水虻（Hermetia illucens）和黄粉虫（Tenebrio molitor）均达到80.0%。Shelfordella tartara被完全错误分类为Blaptica dubia，表明这两个近缘蟑螂物种之间存在强烈的光谱相似性。VIP得分分析确定了1700–1800 cm^?1区域（主要对应于脂质酯羰基振动）为最具区分性的光谱范围。结果表明，拉曼光谱能够提供昆虫PBS可提取组分的分类学相关生化指纹，同时也强调了需要扩展参考库、改进采样策略以及在复杂食品基质中进行验证，以进一步开发其作为筛查方法的潜力。

**论文解读：基于拉曼光谱的PBS可提取组分鉴别食用与饲料昆虫物种的研究**

**研究背景与问题**

随着全球对可持续蛋白质来源需求的增长，食用昆虫作为传统畜牧业的替代方案受到广泛关注。昆虫富含蛋白质和必需氨基酸，且其生产对环境的影响较小。然而，昆虫基食品市场的快速扩张也带来了食品真实性、标签透明度、法规合规性以及潜在过敏风险等问题。在欧盟，食用昆虫被归类为新型食品（Novel Foods），需经上市前安全评估和授权。目前仅少数物种（如黄粉虫Tenebrio molitor幼虫、家蟋Acheta domesticus等）获准用于人类消费，而其他物种（如黑水虻Hermetia illucens、蟑螂Blaptica dubia等）可能仅用于饲料或宠物活食。因此，区分授权与非授权昆虫物种对于执行食品标签法规、检测食品掺假至关重要。

传统检测方法（如聚合酶链式反应PCR、色谱分析、光学显微镜）存在耗时长、样品制备复杂、破坏性强或依赖形态学特征等局限。振动光谱技术（如近红外、中红外、拉曼光谱）具有非破坏性、快速、所需样品制备少等优势，其中拉曼光谱对分子结构敏感，不易受水干扰，适合分析水溶液样品。然而，目前针对食用昆虫拉曼光谱区分的研究有限，且大多关注简化模型或少数物种，缺乏对多物种（包括授权与非授权物种）的系统评估及光谱特征的生化解释。

**研究目的**

本研究旨在评估拉曼光谱结合化学计量学分析检测和区分选定食用与饲料昆虫物种的潜力，确定能否成功区分昆虫提取物与溶剂基质，以及不同昆虫物种，并识别关键光谱区域。研究还通过纳入欧盟授权和非授权物种，探讨该方法在法规合规方面的应用意义。

**主要关键技术与方法**

研究人员从捷克共和国一家私人昆虫养殖场收集了2023年和2024年共96个干燥昆虫样品，涵盖9个物种：Acheta domesticus（AD）、Gryllus assimilis（GA）、Tenebrio molitor（TM）、Zophobas morio（ZM）、Alphitobius diaperinus幼虫（ALD）、Blaptica dubia（BD）、Shelfordella tartara（ST）、Apis mellifera雄蜂（AM）和Hermetia illucens（HI）。样品经饥饿处理、冷冻干燥、液氮低温均质后，以pH 9.4的磷酸盐缓冲液（PBS）进行超声辅助提取，离心过滤后立即采集拉曼光谱。使用785 nm激发波长的拉曼光谱仪，在200–2000 cm^?1范围采集光谱，每个物理样品获得4个技术重复光谱。经过质量控制，保留358个昆虫光谱和7个PBS光谱。光谱预处理采用二阶Savitzky–Golay导数结合标准正态变量（SNV）归一化。采用主成分分析（PCA）进行无监督探索，偏最小二乘判别分析（PLS-DA）进行有监督分类，通过5折交叉验证评估模型性能，并利用变量重要性投影（VIP）得分识别关键光谱区域。

**研究结果**

**3.1 拉曼光谱特征**
研究人员观察到昆虫提取物的拉曼光谱在700–1050 cm^?1（多糖/蛋白质相关）、1200–1350 cm^?1（酰胺III）、1440–1460 cm^?1（CH₂/CH₃变形）、1600–1670 cm^?1（酰胺I/C=C振动）和1700–1800 cm^?1（脂质酯C=O）区域存在差异。幼虫样品（如TM、ZM、ALD、HI）在700–960 cm^?1区域表现出更明显的特征，而成虫（如AD、GA、BD、ST）在1200–1350和1600–1670 cm^?1区域光谱相似。BD和ST的光谱几乎重叠，表明近缘蟑螂物种间生化组成高度相似。仅凭视觉光谱无法可靠区分，需进行多变量分析。

**3.2 探索性与有监督多变量分析**
PCA得分图显示，PC1和PC2分别解释41.7%和25.5%的方差，但昆虫物种间存在显著重叠，表明无监督分析无法实现完全物种区分。PLS-DA得分图（LV1和LV2分别解释39.3%和31.9%方差）显示出更清晰的分离趋势：PBS缓冲液与昆虫提取物沿LV1分离，但多数昆虫物种间仍有重叠。高阶潜变量能改善部分类别（如AM）的分离，但近缘物种（如ST和BD）仍重叠严重。

**3.3 交叉验证**
通过5折交叉验证，PLS-DA模型的总体正确分类率（CCR）为61.6%（365个样本中225个正确分类）。AM的CCR最高（100.0%），其光谱特征独特；HI和TM的CCR均为80.0%，可能与幼虫期特有的生化特征有关。ALD的CCR仅为26.7%，ST的CCR为0%，所有ST样本均被错误分类为BD，表明两者光谱特征几乎一致。AD和GA之间存在部分误分类，反映它们同属直翅目且均为成虫，光谱相似。

**3.4 关键光谱区域**
VIP得分分析表明，600–1300 cm^?1、1400–1500 cm^?1和1700–1800 cm^?1区域对分类贡献最大，其中1750 cm^?1附近（脂质酯C=O伸缩）VIP值最高。这些区域对应脂质、蛋白质和多糖的振动，但VIP得分应视为多变量贡献，而非单一化合物生物标志物。研究还指出，碱性PBS提取可能引起蛋白质部分构象变化，但短时间提取下碱性水解可能性低，所得光谱代表特定提取条件下的可提取组分指纹。

**讨论与结论**

讨论部分指出，本研究属于概念验证，而非经过验证的常规认证方法。总体CCR中等（61.6%），以及ST和BD的完全误分类，表明当前数据集和模型不足以实现所有物种的可靠物种级别认证。误分类可能源于近缘物种间真实的生化相似性，也可能受类别不平衡、物理样品数量有限以及昆虫材料异质性影响。研究建议未来需扩展并平衡参考库、增加独立提取重复、改进模型验证，并在复杂食品基质中测试。拉曼光谱有望作为多方法认证策略的一部分。

**研究结论翻译**：
本研究证明，对PBS可提取昆虫组分的拉曼光谱结合化学计量学分析，具有作为区分选定昆虫源材料的初步筛查方法的潜力。该方法对某些分类群（尤其是西方蜜蜂Apis mellifera、黑水虻Hermetia illucens和黄粉虫Tenebrio molitor）表现出良好性能，且区分性信息在脂质相关光谱区域最为显著。然而，总体中等分类率（61.6%）以及Shelfordella tartara被完全误分类为Blaptica dubia的事实，确认该方法尚不能作为独立的法规物种认证手段。结果应被解释为基于拉曼光谱的PBS可提取昆虫组分指纹图谱的概念验证，而非常规认证方法的验证。进一步开发应聚焦于扩展和平衡参考库、增加物理样品和独立提取重复数量、改进模型验证，以及在复杂食品基质中测试该方法。拉曼光谱最终可能作为昆虫源材料多方法认证策略的一个组成部分。