《Acta Biomaterialia》：Lysosomal Disruption Elicits Immunogenic Cell Death: A Saponin-Nanoaluminum Adjuvant for Enhanced Cancer Immunotherapy
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摘要诱导溶酶体膜通透性变化是一种替代性治疗策略，它无需针对常规的基因或蛋白质靶点，而是通过物理方式破坏肿瘤来引发细胞死亡。本研究将经美国食品药品监督管理局批准、具有破坏膜功能的皂苷QS-21负载到铝基佐剂上（称为QS-NanoAlum），以此通过“自我溶解”机制诱导溶酶体膜通透性
摘要
诱导溶酶体膜通透性变化是一种替代性治疗策略，它无需针对常规的基因或蛋白质靶点，而是通过物理方式破坏肿瘤来引发细胞死亡。本研究将经美国食品药品监督管理局批准、具有破坏膜功能的皂苷QS-21负载到铝基佐剂上（称为QS-NanoAlum），以此通过“自我溶解”机制诱导溶酶体膜通透性变化，并引发肿瘤免疫原性细胞死亡。得益于其正电荷特性，静脉注射后的QS-NanoAlum能够轻易附着在肿瘤细胞膜上，从而实现高效的细胞内吞。在酸性的溶酶体环境中，QS-NanoAlum会发生降解，释放出QS-21，进而导致溶酶体膜通透性变化以及水解酶的胞质泄漏。这些释放出的水解酶与QS-21会进一步破坏细胞结构及各种细胞器，包括细胞膜、细胞核、线粒体和内质网，最终引发肿瘤免疫原性细胞死亡。值得注意的是，过量的QS-NanoAlum能够在肿瘤免疫原性细胞死亡过程中有效吸附释放出的肿瘤相关蛋白抗原，在注射部位形成抗原储存库，持续提供长期的免疫刺激。我们的体内实验还表明，QS-NanoAlum能够显著抑制肿瘤生长，并促进免疫细胞向肿瘤组织中浸润。总体而言，这种通过物理方式破坏细胞的“回收中心”来引发细胞解体并诱发强烈肿瘤免疫原性细胞死亡的策略，为癌症免疫疗法提供了新的思路。
重要性说明
传统的癌症治疗方法主要针对特定的突变，但会受到肿瘤异质性和耐药性的限制。我们提出了一种新的策略，即通过溶酶体膜通透性变化直接破坏肿瘤细胞，无需依赖分子靶点。我们所设计的QS-NanoAlum系统（将QS-21负载到铝基佐剂上）可通过“自我溶解”机制引发免疫原性细胞死亡。带正电荷的QS-NanoAlum被细胞内吞后在酸性的溶酶体中降解，释放出QS-21，进而诱导溶酶体膜通透性变化。释放出的水解酶会造成多种细胞器的损伤，最终引发强烈的免疫原性细胞死亡。此外，过量的QS-NanoAlum还能吸附肿瘤相关抗原，形成可持续的免疫刺激储存库。在体内实验中，QS-NanoAlum确实能够抑制肿瘤生长并促进免疫细胞浸润，这充分证明了其在癌症免疫疗法中的应用潜力。
引言
溶酶体作为细胞内重要的降解场所，通过各类水解酶处理外来物质和细胞内摄取的物质，对维持细胞稳态起着关键作用[1,2]。该细胞器的功能异常与多种病理状况密切相关，因此，那些能够选择性靶向溶酶体功能的疗法备受关注，成为新的治疗手段。例如，热休克蛋白70和V-H?-ATP酶质子泵这类分子靶点正在肿瘤学研究中得到应用，其作用机制主要是改变溶酶体的pH值或诱导溶酶体膜通透性变化[[]3], [[]4], [[]5]]。肿瘤细胞溶酶体典型的酸性环境（pH值在4.5-5.0之间）也为设计易被酸性环境破坏的前体药物和pH响应型纳米载体提供了理论依据，从而实现药物在特定部位的释放[[]6,[]7]。
保持溶酶体膜的完整性对于封存其内的强效酶类物质至关重要。完整的溶酶体膜能够实现可控的降解过程，而一旦因溶酶体膜通透性变化或破裂导致膜结构受损，细胞质中的物质就会不受控制地释放出来。这一过程会促使组织蛋白酶等水解酶外流，进而引发一种被称为溶酶体细胞死亡的程序性细胞死亡形式[[]8,[]9]。恶性肿瘤往往会导致溶酶体膜在结构和功能上发生改变，使其变得更加脆弱，更容易受到能够诱导溶酶体膜通透性变化的物质的影响[[]10]。癌细胞中的溶酶体通常会出现肥大现象，其体积、数量以及蛋白水解活性（如组织蛋白酶的活性）都会升高，这就为针对性治疗提供了机会[[]11]。尽管已有几种能够积累在溶酶体中并诱导溶酶体膜通透性变化的小分子化合物进入临床试验阶段，但它们在区分癌细胞和健康细胞方面的选择性仍然不足，这一难题至今仍未解决。
纳米粒子系统在生物医学领域具有诸多优势，比如合成简便、表面功能化程度高，以及能够精确调控其物理化学性质[[]12], [[]13], [[]14], [[]15], [[]16], [[]17], [[]18], [[]19]]。在肿瘤学中的应用更是显著提升了治疗效果，因为它能够提高药物的溶解度、增强药物的生物利用度，同时降低药物对非目标组织的毒性[[]20], [[]21], [[]22], [[]23]]。过去，纳米医学的主要研究方向是利用纳米粒子作为被动递送载体，优化药物的药代动力学特性。不过，越来越多的研究表明，那些经过特殊设计、具有特定结构或表面特性的纳米粒子能够直接产生生物学效应。要设计出安全且能与细胞膜及抗原蛋白发生相互作用的高效纳米材料，就需要深入理解纳米材料与这些生物界面之间的相互作用机制[[]24], [[]25], [[]26]]。这类相互作用可能发生在物质被细胞内吞之前的细胞膜层面，也可能发生在物质进入细胞后被内体或溶酶体膜接触时，涉及黏附、膜变形、直接穿透或受体介导的内吞等多种过程[[]27]。由于溶酶体本身的结构特点，比如膜弹性有限且腔室空间狭小，这就为那些不依赖离子泵、能够通过物理方式使溶酶体膨胀的疗法提供了应用可能[[]28]。目前用于促进溶酶体破裂以提升药物递送效果的方法包括在溶酶体内部形成凝胶、结晶、进行原位聚合，或是让内吞进来的纳米粒子聚集在一起[[]29,[]30]。这些方法都是利用了溶酶体处理较大聚集体能力有限的特性，从而造成渗透压失衡、细胞器肿胀，最终引发溶酶体膜通透性变化。不过，许多现有方法的明显缺陷在于其组成成分本身具有毒性，这一特性使得它们大多只能用于在恶性细胞中引发严重的溶酶体破坏。因此，迫切需要开发一种可控的、通过物理方式触发溶酶体膨胀的策略，这种策略既要安全，又能引发具有治疗意义的免疫反应，尤其是肿瘤免疫原性细胞死亡[[]31], [[]32], [[]33], [[]34], [[]35], [[]36], [[]37]]。
佐剂在疫苗设计中起着至关重要的作用，能够增强免疫反应。其中，QS-21是一种源自皂荚树皮的强效植物来源佐剂，它能够提升抗原的呈现效率，促进T细胞的增殖，同时增加细胞因子的分泌量[[]38], [[]39], [[]40]]。作为经过临床验证的AS01佐剂系统的核心成分，QS-21具备破坏膜的功能，这一特性使得人们有望将其用于直接诱导肿瘤细胞中的溶酶体膜通透性变化[[]41], [[]42], [[]43]]。在本研究中，我们研发出了QS-NanoAlum，这是一种负载有QS-21的纳米级铝基佐剂，旨在通过“自我溶解”机制在肿瘤细胞中诱导溶酶体膜通透性变化，进而引发肿瘤免疫原性细胞死亡。得益于其正电荷特性，静脉注射后的QS-NanoAlum能够通过静电作用轻易附着在肿瘤细胞膜上，从而实现高效的细胞内吞。在酸性的溶酶体环境中，QS-NanoAlum会发生降解，释放出QS-21，进而导致溶酶体膜通透性变化以及水解酶的胞质泄漏。这些释放出的水解酶与QS-21一起会进一步破坏细胞结构及各种细胞器，最终引发肿瘤免疫原性细胞死亡。值得注意的是，过量的QS-NanoAlum能够有效吸附释放出的肿瘤相关蛋白抗原，在注射部位形成抗原储存库，持续提供长期的免疫刺激。另有研究指出，溶酶体膜通透性变化常常与其他多种细胞死亡途径同时发生，这类现象通常是由活性氧驱动的[[]44]。而我们的研究则旨在将溶酶体膜通透性变化作为一种直接的致病因素。通过利用溶酶体的酸性环境，QS-NanoAlum能够作为启动因子直接诱导溶酶体膜通透性变化，进而引发一系列水解反应，最终高效地诱发肿瘤免疫原性细胞死亡。这是一种与以往依赖活性氧引发溶酶体膜通透性变化的策略不同的新方法，它采用明确的“以溶酶体膜通透性变化为核心”的机制来开展癌症免疫疗法。
章节节选
材料
皂苷（QS-21，来自皂荚树皮）由上海桑根生物科技有限公司提供。六水合氯化镁（MgCl?·6H?O，纯度99.99%）、六水合氯化铝（AlCl?·6H?O，纯度99.99%）、牛血清白蛋白（BSA，纯度≥96%）、香豆素-6（纯度≥98%）以及结晶紫（AR）均来自中国上海的阿拉丁公司。96%的乙醇、37%的盐酸以及98%的氢氧化钠则由中国上海的国药集团化学试剂有限公司提供。醋酰氧甲基花青素
结果与讨论
NanoAlum最初是根据我们之前的研究结果，通过传统的共沉淀法制备的[[]45,[]46]。如图1a-d所示，所制备的NanoAlum具有明显的层状结构，颗粒大小约为250纳米（范围在50到500纳米之间，见图S1）。通过高分辨率透射电子显微镜结合选区电子衍射技术分析后，可以看到清晰的衍射斑点，这说明NanoAlum的结晶度很高。随后，
结论
综上所述，我们成功研发出一种负载有QS-21的NanoAlum佐剂，该佐剂具有良好的生物安全性，可通过诱导溶酶体膜通透性变化来引发肿瘤免疫原性细胞死亡。带正电荷的QS-NanoAlum能够通过静电作用附着在细胞膜上。进入细胞后，它在肿瘤细胞的溶酶体中发生降解，进而释放出具有破坏膜功能的QS-21，最终导致溶酶体膜通透性变化。这种膜结构的破坏
CRediT作者贡献说明
陆静松：负责原始论文撰写、软件应用、方法设计、实验研究、资金申请、正式数据分析、数据整理以及概念构思工作。于静：负责项目监督、项目管理、资金申请以及概念构思工作。郭振华：负责软件应用、方法设计以及数据整理工作。陈苏梅：负责方法设计、实验研究以及数据整理工作。李颖：负责软件应用以及方法设计工作。孙晴：负责项目监督以及软件应用工作。应瑶：负责项目监督以及方法设计工作。李娟：负责方法设计以及实验研究工作。乔亮：负责软件应用工作，
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