饲料中添加不同水平胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸（CpG ODNs）对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）生长性能、免疫力、消化能力、肠道菌群及转录组响应的影响

《Animals》：Effects of Dietary CpG Oligodeoxynucleotides (CpG ODNs) Supplementation Levels on Growth Performance, Immunity, Digestive Capacity, Intestinal Microbiota, and Transcriptomic Response in Litopenaeus vannamei

　　

本研究评估了饲料中添加胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸（CpG ODNs）对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）生长性能、免疫状态、消化功能、肠道菌群及转录组响应的影响。研究人员将初始体重为0.30 ± 0.02 g的凡纳滨对虾饲喂分别添加0、0.1、0.4、1.6、6.4或25.6 mg kg?1 CpG ODNs的饲料为期8周。饲料中添加CpG ODNs并未显著改善大多数生长参数；然而，饲喂添加1.6 mg kg?1 CpG ODNs饲料的凡纳滨对虾表现出较低的饲料转化率（Feed Conversion Ratio, FCR）。经白斑综合征病毒（White Spot Syndrome Virus, WSSV）攻毒后，饲喂添加25.6 mg kg?1 CpG ODNs饲料的凡纳滨对虾存活率高于对照组，而副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）攻毒后的存活率在各处理间无显著差异。饲料中添加水平高于0.4 mg kg?1的CpG ODNs提高了多种血清免疫相关及抗氧化酶活性，降低了丙二醛（Malondialdehyde, MDA）含量，并增强了肠道胰蛋白酶和淀粉酶活性。此外，该处理增加了微生物丰富度指数，同时降低了弧菌属（Vibrio）和发光杆菌属（Photobacterium）的相对丰度。转录组分析显示，与对照组相比，CpG ODNs（高于0.4 mg kg?1）组中的多个通路显著富集，包括AMP活化蛋白激酶（AMPK）信号通路和Janus激酶-信号转导与转录激活因子（JAK–STAT）信号通路。综上所述，饲料中添加CpG ODNs未显著改善凡纳滨对虾的生长性能。然而，饲料中添加水平高于0.4 mg kg?1的CpG ODNs可能有助于增强凡纳滨对虾的免疫与消化功能并调节其肠道菌群组成。

该研究发表于《Animals》。凡纳滨对虾是全球广泛养殖的甲壳类物种，集约化养殖在提升生产效率的同时，也使养殖对虾暴露于病原体感染、环境波动、高密度应激及营养失衡等多种生物与非生物胁迫下，导致免疫机能受损、氧化还原稳态紊乱、消化吸收功能下降，最终降低生长性能、饲料利用率及存活率。因此，支持免疫机能、抗氧化防御、消化功能及肠道稳态的营养策略对对虾养殖可持续发展至关重要。功能性饲料添加剂如益生菌、益生元、植物源生物活性物及免疫刺激剂已被广泛研究，其中胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸（CpG ODNs）是含非甲基化CpG基序的合成DNA分子，可模拟微生物DNA的免疫刺激信号，在水生动物中能增强病原抵抗力、提升免疫及抗氧化酶活、调节免疫相关基因表达及改善应激耐受性。既往甲壳类研究表明单个或串联CpG ODNs可增强抗感染能力并改善生长，序列依赖效应及特定串联构建体具强免疫调节效果，转录组与microRNA组学亦证实其影响免疫调节、代谢等多分子过程。然而既往研究多聚焦固定添加水平下的序列筛选与机制表征，明确多序列CpG ODNs制备的剂量效应关系、有效膳食范围及最佳添加水平尚不清楚，且不同膳食水平是否诱导饲料利用、消化功能、免疫状态、抗病性、肠道菌群及宿主转录调控的协调或终点特异性响应亦不明确。研究人员假设梯度添加多序列CpG ODNs制备体会诱导凡纳滨对虾生理、免疫、微生物及转录状态的剂量依赖性潜在非线性响应，旨在评估其对凡纳滨对虾生长性能、免疫状态、消化功能、抗病性、肠道菌群组成及转录组响应的影响，为开发绿色安全高效功能性饲料添加剂及减少水产养殖抗生素与化学疗法依赖提供理论基础。

研究人员采用的主要关键技术方法如下：选取初始体重0.30 ± 0.02 g的健康凡纳滨对虾作为样本队列，设置6个等氮等脂膳食CpG ODNs水平（0、0.1、0.4、1.6、6.4、25.6 mg kg^?1）分组饲养8周；结束后计算生长性能指标，采集血淋巴、血细胞、肠道样本；进行副溶血弧菌与白斑综合征病毒（WSSV）攻毒测试并记录累积死亡率；测定血清非特异性免疫、抗氧化参数及肠道消化酶活性；提取肠道细菌DNA进行16S rDNA测序分析菌群；提取血细胞总RNA进行转录组测序分析及差异表达基因（DEGs）定量实时荧光定量PCR（qPCR）验证；采用单因素方差分析（One-way ANOVA）与Duncan多重范围检验、Kaplan–Meier生存曲线与log-rank检验、DESeq2包进行统计分析。

研究结果如下：

3.1. 生长性能。研究人员通过比较各组初始体重（IBW）、终末体重（FBW）、增重率（WGR）、存活率（SR）、特定生长率（SGR）及饲料转化率（FCR）发现，与对照组相比，1.6 mg kg^?1组FCR显著降低，其余生长参数无显著差异；基于WGR与SGR的回归分析预测最佳膳食CpG ODNs添加水平分别为12.65和12.75 mg kg^?1。

3.2. 凡纳滨对虾病原攻毒测试。研究人员通过记录攻毒后存活率变化得出，副溶血弧菌攻毒72 h后各组存活率无显著差异；WSSV注射120 h后，25.6 mg kg^?1组存活率显著高于对照组，其余组无显著差异。

3.3. 血清生化指标分析。研究人员测定血清酶活与丙二醛（MDA）含量发现，与对照组相比，6.4和25.6 mg kg^?1组溶菌酶（LZM）活性显著升高，25.6 mg kg^?1组碱性磷酸酶（AKP）活性显著升高；酸性磷酸酶（ACP）活性在CpG ODNs添加组均显著升高且6.4 mg kg^?1组最高；除0.1 mg kg^?1组超氧化物歧化酶（SOD）及0.1、0.4 mg kg^?1组过氧化氢酶（CAT）外，其余添加组SOD、酚氧化酶（PO）、CAT活性均显著高于对照组，SOD与CAT活性峰值在6.4 mg kg^?1组，PO活性峰值在1.6 mg kg^?1组；0.1 mg kg^?1组天冬氨酸氨基转移酶（AST）显著升高，其余组无显著差异；0.4 mg kg^?1组丙氨酸氨基转移酶（ALT）显著升高，1.6、6.4、25.6 mg kg^?1组显著降低，0.1 mg kg^?1组与对照组无差异；除0.1 mg kg^?1组外，其余添加组血清MDA含量显著降低。

3.4. 肠道消化酶活性。研究人员测定肠道酶活发现，与对照组相比，1.6、6.4、25.6 mg kg^?1组胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性显著升高，其中胰蛋白酶与脂肪酶峰值在1.6 mg kg^?1组，淀粉酶峰值在6.4 mg kg^?1组；0.1 mg kg^?1组无显著差异；0.4 mg kg^?1组胰蛋白酶与淀粉酶显著升高，脂肪酶无差异；总蛋白（TP）含量各组无显著差异。

3.5. 肠道菌群群落。3.5.1. 肠道菌群多样性与丰富度。研究人员通过β多样性主坐标分析（PCoA）与α多样性分析发现，不同水平CpG ODNs影响肠道微生物群落；各组建有不同数量独有OTU；与对照组相比，CpG ODNs添加显著提高肠道菌群Sobs、ACE及Chao1指数，Shannon与Simpson指数无显著差异。3.5.2. 肠道菌群组成。研究人员在门水平发现群落以变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、浮霉菌门（Planctomycetes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）为主，CpG ODNs未显著影响变形菌门与拟杆菌门相对丰度，0.1、0.4、6.4、25.6 mg kg^?1组浮霉菌门显著高于对照组，1.6 mg kg^?1组与对照组无差异；在属水平以弧菌属（Vibrio）、Tenacibaculum属、Ruegeria属、Hoppeia属为主，除0.1 mg kg^?1组弧菌属外，其余添加组弧菌属与发光杆菌属（Photobacterium）相对丰度显著降低；0.4、6.4、25.6 mg kg^?1组Ruegeria属显著高于对照组，0.1与1.6 mg kg^?1组与对照组无差异。

3.6. 转录组测序分析。3.6.1. 组装与序列比对分析。研究人员过滤低质量序列后获得清洁数据，平均GC含量大于49.80%，Q20与Q30分别超97.17%与92.28%，总体比对率大于88.65%，外显子比对超88.05%，内含子低于7.27%，测序质量可用于分析。3.6.2. 差异表达基因（DEGs）分析。研究人员在C0 vs C0.1、C0 vs C0.4、C0 vs C1.6、C0 vs C6.4、C0 vs C25.6中分别鉴定3200、1629、2015、8294、1606个DEGs，各组共享300个DEGs。3.6.3. DEGs的GO富集分析。研究人员将DEGs划分为51个二级GO子类，含24个生物过程、17个细胞组分、10个分子功能。3.6.4. DEGs的KEGG富集分析。研究人员将DEGs映射到41个KEGG子类，归属代谢、有机体系统、人类疾病、遗传信息处理、细胞过程、环境信息处理六大类；C0.4、C1.6、C6.4、C25.6组共享AMPK信号通路与JAK–STAT信号通路显著富集。3.6.5. qPCR验证。研究人员随机选取12个DEGs验证，qPCR表达模式与转录组测序数据一致。

讨论部分总结：研究人员指出饲料添加超0.1 mg kg^?1 CpG ODNs未显著改善凡纳滨对虾生长性能，回归分析预测最优水平为12.65与12.75 mg kg^?1，与河蟹研究结果差异源于物种、发育阶段等不同；1.6 mg kg^?1组FCR降低可能与肠道消化能力增强有关，但消化酶提升未转化为稳定生长优势。甲壳类无经典适应性免疫，CpG ODNs提升免疫与抗氧化酶活及WSSV后存活率，表明其增强非特异性免疫与抗氧化能力；对副溶血弧菌无显著保护呈病原特异性，与病原相关分子模式（PAMPs）、模式识别受体（PRR）激活及效应机制差异有关。CpG ODNs提高肠道菌群Chao1与ACE指数，降低弧菌属与发光杆菌属丰度、提升Ruegeria属丰度，改善菌群组成。转录组显示生长与基因表达效应均呈非线性，CpG ODNs通过多生物过程调控而非单一免疫通路，超0.4 mg kg^?1影响AMPK与JAK–STAT通路调节免疫。研究存在高添加量区间无中间水平、每处理独立水箱有限、可控水族条件与8周幼虾期限制等不足，需后续窄剂量间隔、增加重复、长期及商业池塘验证。

结论部分翻译：饲料中添加CpG ODNs未显著改善凡纳滨对虾的生长性能。然而，添加25.6 mg kg^?1 CpG ODNs增强了对抗白斑综合征病毒攻毒的抵抗力。饲料中添加水平高于0.4 mg kg^?1的CpG ODNs显著提高了消化与免疫酶活性，改善了肠道菌群组成，并诱导了有益的相关免疫转录组响应。

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