《Animals》：Correction: Zhao et al. Isoleucine Enhanced the Function of the Small Intestinal Mucosal Barrier in Weaned Piglets to Alleviate Rotavirus Infection. Animals 2024, 14, 3146
编辑推荐：
精液冷冻保存是生殖生物技术与低温生物学交叉的重要跨学科领域，对于濒危物种的遗传拯救、种质资源的长期保存以及畜禽和水产养殖的繁殖管理具有重要价值。尽管该技术在鱼类和陆生哺乳动物中已较为成熟，但在海洋哺乳动物特别是鲸类中仍面临诸多挑战。长江江豚是中国稀有且特有的淡
精液冷冻保存是生殖生物技术与低温生物学交叉的重要跨学科领域，对于濒危物种的遗传拯救、种质资源的长期保存以及畜禽和水产养殖的繁殖管理具有重要价值。尽管该技术在鱼类和陆生哺乳动物中已较为成熟，但在海洋哺乳动物特别是鲸类中仍面临诸多挑战。长江江豚是中国稀有且特有的淡水江豚，其精液冷冻保存研究仍处于早期阶段，迫切需要开发一套适合其独特生理特征的技术体系。研究人员在PubMed、Web of Science和中国知网（CNKI）中检索了从建库至2025年5月的文献。本结构化叙述性综述基于77篇核心出版物，包括8篇关于鲸类精液冷冻保存的原始研究。本结构化叙述性综述综合了鲸类精液冷冻保存研究的证据，特别强调了宽吻海豚、太平洋斑纹海豚、虎鲸和白鲸的技术见解。此外，还结合了其他物种研究在稀释液配方和冷冻保护剂方面的进展，以总结适用于长江江豚精液冷冻保存的关键技术参数，旨在为建立该物种高效、安全的冷冻保存体系提供理论基础和实践框架。
1. 引言
许多鲸类处于营养级的顶端，在维持食物网稳定性和生态平衡方面发挥着重要的生态作用。然而，它们经过长期进化形成的特殊繁殖策略，如季节性繁殖、复杂的交配系统和低繁殖率，使其对环境干扰高度敏感。目前，全球鲸类面临栖息地破碎化、过度捕捞、水污染和航运噪音等多重人为威胁。以长江江豚为例，其有效种群大小少于92个个体，观测杂合度低至0.653，表明遗传多样性极低。鉴于此，辅助生殖技术，特别是精液冷冻保存，被公认为克服现有瓶颈的关键策略。然而，冻融过程引起的冰晶形成、渗透冲击、氧化应激和膜完整性破坏在不同物种间存在显著差异。因此，针对陆生哺乳动物开发的成熟方案不能直接应用，必须进行系统性的物种特异性研究。
2. 文献检索策略与综述方法论
考虑到现有文献的高度异质性，本综述采用结构化文献检索支撑的叙述性综述方法。文献检索在PubMed、Web of Science和CNKI中进行。通过核心主题检索和补充性的雪球检索策略，共获得77篇核心记录。筛选过程由单一审稿人完成，并基于预定义的纳入和排除标准评估，最终提取了物种、精液采集方法、稀释液成分、渗透压、冷冻保护剂类型及浓度、包装格式、冷却速率、解冻条件、冻后活力及人工授精（AI）结局等信息进行叙述性综合。
3. 鲸类生殖生理与精液特征概述
3.1 雄性鲸类生殖系统的解剖与生理特征
作为完全水生哺乳动物，鲸类雄性生殖系统在进化中发生了显著重塑。其阴茎为纤维弹性型，松驰时通过乙状弯曲缩回体内，这要求人工阴道或电采精程序必须适应其结构特征。在生殖生理方面，宽吻海豚的抑制素水平在性成熟前显著高于成熟后，而促卵泡素（FSH）在成熟后升高。睾酮水平在春季达到峰值，但精子浓度在秋季最高。虎鲸的睾酮水平从春季到初秋显著增加，但精子浓度无季节性变化。东亚江豚在3-3.5岁时睾丸发育出现关键转折点，性成熟期约为5岁。由于长江江豚和东亚江豚分类关系密切，利用东亚江豚数据外推具有合理性，但需考虑环境差异的局限性。
长江江豚的睾丸位于腹腔内，呈长圆柱状。性成熟后，繁殖季平均性腺体积显著增加。血清激素水平显示，性成熟雄性春季睾酮范围为2.64至9.40 ng/mL。粪便激素监测表明其繁殖期主要集中在3月至9月。
3.2 精液的宏观与微观特征
鲸类精子头部扁平呈卵圆形，顶体脊明显，顶体后区表现出明显的种间差异，且缺少赤道段。这些特征直接影响冷冻保护剂的渗透性和冰核形成。
精液量和浓度在不同物种间差异显著。长江江豚精子浓度（4.17 × 10
9/mL）显著高于太平洋斑纹海豚和虎鲸。精子形态、活力和存活率方面，虎鲸精子头部近方形，宽吻海豚和太平洋斑纹海豚具有14-16条纵向脊，而长江江豚侧面呈梨形，无明显特殊结构。超微结构决定了精子对冷冻损伤的敏感性，如膜脂质组成、胆固醇/磷脂比和多不饱和脂肪酸（PUFAs）影响膜的流动性和抗冷冻性。
3. 精液采集技术与面临的挑战
精液采集是基础环节，但面临多重挑战。
4.1 电采精
在鲸类中仅有一次成功案例，由于动物福利和伦理限制，仅在无法训练且无替代方案的极特殊情况下使用。
4.2 正向强化训练自愿采集（PRT）
PRT结合操作性条件反射是可训练齿鲸的金标准。该方法自愿参与、低应激且可重复性好，但训练时间长，且依赖经验丰富的训练员。
4.3 死后附睾精子回收
作为遗传资源抢救的最后机会，精子质量死后迅速下降。建议在4-5°C下快速运输，24小时内分离并冷冻。由于附睾精子缺乏精浆，需要外源保护剂补偿。
采集方法直接影响精子质量、膜完整性和冷冻存活率，濒危物种项目应优先考虑PRT，建立死后采集作为后备方案。
5. 鲸类精液冷冻保存与解冻核心技术进展
5.1 精液初期处理与评估
精液采集后立即进行离心和稀释。种间离心参数差异大，可能影响膜完整性。评估多采用计算机辅助精子分析（CASA），鲜精质量通常较高，DNA碎片化指数极低。
5.2 冷冻保护剂的选择与优化
甘油是广泛使用的渗透性冷冻保护剂（CPAs），但存在浓度依赖的细胞毒性。非渗透性保护剂如20%卵黄常用于膜保护。无卵黄配方（如LP1和HSPM）虽维持了冻后活力，但LP1在延长培养后DNA碎片显著增加，这可能与植物来源卵磷脂的脂质谱差异导致膜保护不足有关。
5.3 稀释液配方与渗透压选择
常见配方包含Tris、柠檬酸、果糖或葡萄糖及20%卵黄。渗透压通过调节跨膜水流动影响细胞体积和保护剂平衡。不同物种精浆渗透压差异显著，要求种特异性调整稀释液配方。
5.4 冷冻方案的开发与评估
冷冻方案因设备、包装格式和冷却策略而异。冷却速率决定渗透应力与细胞内冰晶形成之间的平衡。包装格式（如细管、定向冷冻管）通过改变热传递效率影响冷冻效果。
5.5 解冻方案标准化
普遍遵循快速升温原则，通常在35°C水浴中进行。包装格式和体积显著影响升温速率，缓慢加热可能导致重结晶和渗透应激。建议有针对性地开发格特式解冻方案。
5.6 解冻后精液质量评估
评估表明，虽然实验室指标如存活率有价值，但并不总能预测受精能力。人工授精（AI）试验显示，宽吻海豚妊娠率为67%，强调了功能测定的必要性。
6. 冷冻精液在辅助生殖与综合保护管理中的应用
6.1 人工授精（AI）
在宽吻海豚中建立了标准化AI方案，使用血清雌二醇（E2）峰值确定授精时机。虎鲸利用宫腔镜引导成功产仔。然而，技术可行性与常规保护应用之间仍存在巨大差距，且严重依赖精确排卵监测和精液质量控制。
6.2 鲸类遗传资源库的建设与扩展
对于长江江豚，种质库建设仍处于早期阶段。未来应重点关注长期遗传管理，遵循科学设计的采样策略，最大化奠基者代表性。除了成熟精子冷冻，精原干细胞（SSC）冷冻是新途径。此外，生物安全对防止病原体保存至关重要。
7. 当前瓶颈与未来方向
7.1 应对种特异性方案差异
标准跨物种方案可能不具生物学可行性，应开发种特异性优化框架。
7.2 扩大分类覆盖与样本基础
当前知识库仅来自极少数物种。样本量极其有限，是证据基础和验证的最大障碍。
7.3 开发功能性精子评估工具
现有常规指标无法准确预测受精能力。应建立基础指标、功能生物标志物及实际生育结果的多参数评估系统。
7.4 解冻后处理与功能干预策略
为最大化受精潜力，可探索偏振双折射筛选、化学激活、密度梯度离心和抗氧化干预等策略，但需结合种特异性验证。最终，精液冷冻保存应视为综合保护管理的补充工具。
