基于普鲁士蓝包被金纳米酶的三模态侧流免疫分析法，用于高灵敏度且可靠的C反应蛋白检测

《Analytica Chimica Acta》：Tri-modal lateral flow immunoassay for highly sensitive and reliable detection of C-reactive protein using Prussian blue–coated gold nanozymes

　　

摘要

背景

侧流检测法被广泛用于即时检测生物标志物；然而，传统的基于金纳米粒子的侧流检测法由于采用单一模式的比色读数方式，存在灵敏度不足和定量可靠性差的问题。尤其是对于C-反应蛋白这类具有临床重要意义的蛋白质生物标志物，其可靠定量仍然面临挑战，因为这不仅需要信号放大，还需要在复杂的生物样本中保持分析的稳定性。

结果

本研究开发了一种涂有普鲁士蓝的金纳米酶（Au@PB NZ），该纳米酶将固有颜色特性、催化放大功能以及表面增强拉曼散射技术整合于同一探针中，从而实现C-反应蛋白的敏感且定量检测。这种Au@PB NZ具有深蓝色，便于直接目视观察；同时还具备类似过氧化酶的强活性，可通过氧化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺来实现信号催化放大；此外，其独特的拉曼特征还因金核的等离子体效应而得到进一步增强。当将该探针应用于经抗体功能化的侧流检测条带后，便可实现三种模式的检测，显著提升了视觉、催化和拉曼检测方式的性能。该检测法的检测下限分别为：视觉检测为10 ng/mL，催化检测为0.6 ng/mL，拉曼检测为0.1 ng/mL，在人血清样本中表现出更高的分析灵敏度和可靠的定量能力。

意义

这项工作建立了一种基于三模态纳米酶的侧流检测平台，通过结合信号放大与光谱读数方式，提升了分析的可靠性。所提出的策略为临床重要蛋白质生物标志物的即时定量检测提供了强大且灵活的分析框架，同时也推动了多信号纳米酶驱动的诊断系统的发展。

引言

C-反应蛋白是一种五聚体的急性期蛋白，被公认为是反映全身性炎症的高度敏感指标[1]。在细菌或病毒感染、组织损伤、创伤以及术后并发症等情况发生时，其血清浓度会迅速上升，这一变化能够很好地反映机体的生理应激程度[2]、[3]。正因为具有如此重要的临床价值，C-反应蛋白被广泛用于炎症性疾病和心血管疾病的早期诊断、预后评估以及治疗监测[4]。在众多用于C-反应蛋白定量检测的分析方法中，酶联免疫吸附试验因其依靠抗体与抗原之间的相互作用而具备出色的特异性，至今仍是临床上的黄金标准[5]。不过，酶联免疫吸附试验需要复杂的孵育和洗涤步骤，还需专业操作人员以及实验室设备，因此不太适合在基层或现场进行检测[6]、[7]。这些实际限制凸显出人们需要快速、灵敏且易于使用的诊断工具，以便在远离中心实验室的环境中也能获得可靠的C-反应蛋白定量结果。

侧流免疫检测法因其简单、便携以及无需特殊仪器即可进行目视读数的优点，已成为最受欢迎的即时检测方法之一。传统的基于金纳米粒子的侧流免疫检测法能够在几分钟内生成可见的检测线和对照线，从而实现便捷的定性检测。然而，这类检测方法由于本身呈粉红色，且仅能提供单一信号读数，往往限制了其灵敏度及定量准确性，尤其是在检测如C-反应蛋白这类含量较低的蛋白质生物标志物时更为明显[8]。为克服这些缺陷，人们将具有类似酶的催化活性的纳米酶引入侧流免疫检测系统中，作为天然酶的优质替代品。基于金属氧化物、贵金属或其混合物制成的纳米酶能够催化显色反应（例如对3,3′,5,5′-四甲基联苯胺的过氧化酶样氧化反应），从而放大比色信号，相比传统的金纳米粒子检测剂，具有更高的检测灵敏度[9]、[10]、[11]。除了催化增强作用外，近年来还有一些基于新型纳米材料的检测平台，通过整合荧光、光热效应或拉曼特征等多种检测模式，进一步提升了分析性能[12]、[13]、[14]、[15]、[16]。尽管多模式侧流免疫检测方法越来越受到关注，但现有许多研究主要聚焦于通过竞争性检测方式识别小分子目标物[17]、[18]、[19]。相比之下，为临床重要蛋白质生物标志物设计的多模式检测平台，尤其是那些需要采用夹心免疫检测结构的平台，目前仍相对较少被研究。而且，要实现对蛋白质生物标志物的可靠定量检测，不仅需要信号放大功能，还需严格控制检测的线性度、重复性以及与不同样本基质的兼容性，而这些方面在许多现有的多模式侧流免疫检测系统中依然存在诸多难题。

为解决这些问题，我们开发了一种由涂有普鲁士蓝的金纳米酶构成的多功能纳米酶探针，用于实现C-反应蛋白的多模式检测。普鲁士蓝纳米颗粒由六氰合铁(III)酸铁组成，它在侧流免疫检测信号的生成方面具有独特优势：它在拉曼沉默区域存在约2156 cm^-1处的强拉曼谱带，因此可以实现无干扰的拉曼散射检测；同时它还具有类似过氧化酶的活性，能够催化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺的氧化反应，从而实现比色信号的放大。当这种纳米酶与等离子体效应明显的金核结合后，便形成了Au@PB NZ，它兼具以下特点：首先，得益于金核的增强作用，其拉曼特征没有背景干扰；其次，它具有强大的催化活性，可提升光学检测的灵敏度；第三，它本身具有深蓝色，便于直接目视观察。将这类纳米酶应用于夹心型侧流免疫检测系统中后，便实现了视觉比色检测、催化信号增强以及高灵敏度的拉曼定量检测三种检测模式，从而构建出一个可在临床相关浓度范围内高效且可靠地检测C-反应蛋白的检测平台。这种协同设计有效解决了传统基于金纳米粒子的侧流免疫检测法的诸多局限，同时也展现了多功能纳米酶系统在下一代即时检测生物传感器领域的巨大潜力。

章节节选

材料与试剂

三水合四氯金酸(III)（HAuCl₄·3H₂O，纯度≥99.9%，以痕量金属含量为判定标准）、柠檬酸钠（纯度≥99.0%，ACS级试剂）、碳酸钾（纯度≥99.0%，ACS级试剂）、氰化铁(III)钾（K₃[Fe(CN)₆]，纯度≥99.0%，ACS级试剂）、三水合氰化亚铁钾（K₄[Fe(CN)₆]·3H₂O，纯度为98.5-102.0%，ACS级试剂）、六水合三氯化铁（FeCl₃·6H₂O，纯度为97%，ACS级试剂）、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB，纯度≥99%）、过氧化氢（H₂O₂，35%重量百分比的水溶液，SAFC?品牌）、醋酸钠（纯度≥99.0%，

Au@PB NZ的形态与结构特征

为开发一种能够在侧流免疫检测平台上提升检测灵敏度和可靠性的三模态探针，我们合成了Au@PB NZ[21]。我们使用了平均直径约为39纳米的柠檬酸钠稳定型金纳米粒子作为等离子体核心，以此来引导普鲁士蓝壳层的有序形成（见图1a）。由于普鲁士蓝壳层的均匀沉积在很大程度上取决于金纳米粒子表面的化学性质及其稳定性，因此我们研究了反应pH值对Au@PB NZ合成过程的影响。在酸性条件下（见图

结论

在本研究中，我们开发了一种功能多样的Au@PB NZ，它兼具固有的光学对比度、强大的类似过氧化酶的催化活性，以及由金核放大的无干扰拉曼特征。这些相互补充的特性使得我们能够构建出一种用于检测C-反应蛋白的三模态侧流免疫检测方法，该方法将视觉读数、催化信号放大以及高灵敏度的拉曼定量检测功能整合在了同一个检测体系中。该检测平台展现出极高的特异性，检测性能也得到了显著提升

CRediT作者贡献说明

Xuan Ai Le：负责原始稿件撰写、验证工作、方法设计以及实验研究。Jeong Un Kim：负责验证工作、方法设计以及实验研究。Jee Min Kim：负责原始稿件撰写、验证工作、方法设计以及实验研究，同时还参与概念构思工作。Moon Il Kim：负责稿件审阅与编辑、项目监督、项目管理工作、资金筹集以及概念构思工作。Hyung Geun Ko：负责验证工作、方法设计以及实验研究。Nam Su Heo：负责验证工作、方法设计以及实验研究

利益冲突声明

Ko Hyung Geun和Nam Su Heo两位作者受雇于Luvantix ADM Co., Ltd. 其余作者声明自己不存在任何可能影响本研究结果的已知利益冲突或个人关系。

数据可用性

如有需求，我们将提供相关数据。

利益冲突声明

? 作者们声明自己不存在任何可能影响本研究结果的已知利益冲突或个人关系。

致谢

本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）的资助，该基金由韩国政府（科学信息通信部）提供支持（项目编号为RS-2023-NR077205）；同时，本研究还获得了通过NRF开展的基础科学研究计划的资助，该计划由韩国教育部门提供支持（项目编号为RS-2021-NR060117）。此外，本研究还在2025年获得了韩国食品药品安全厅的资助（项目编号为25192MFDS001）。

Jee Min Kim|Xuan Ai Le|Jeong Un Kim|Hyung Geun Ko|Nam Su Heo|Moon Il Kim

韩国京畿道城南市苏井区城南大路1342号，加春大学生物纳米技术系，邮编13120