《Analytica Chimica Acta》：Precise Mapping of O-Glycosylation in the Hinge Region of Serum IgA1 via Site-Specific O-Glycoprotease Coupled with Ultra-high-Resolution Mass Spectrometry
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摘要由于免疫球蛋白A1（IgA1）铰链区的糖基化位点密度高且存在大量微观差异，对其O-糖基化的特征分析一直颇具挑战。在此，我们开发了一种集成工作流程，结合使用铜绿假单胞菌的免疫调节金属蛋白酶（IMPa）和胰蛋白酶进行双酶消化，同时运用高分辨率质谱技术，包括高能碰撞解离技术以及基于
摘要
由于免疫球蛋白A1（IgA1）铰链区的糖基化位点密度高且存在大量微观差异，对其O-糖基化的特征分析一直颇具挑战。在此，我们开发了一种集成工作流程，结合使用铜绿假单胞菌的免疫调节金属蛋白酶（IMPa）和胰蛋白酶进行双酶消化，同时运用高分辨率质谱技术，包括高能碰撞解离技术以及基于HCD产物依赖的电子转移/高能碰撞解离技术。该策略能够生成较短的、具有特定位点的O-糖肽，从而在降低分析复杂度的同时保留完整的糖链结构。通过这种方法，我们分析了103种O-糖肽和13种O-糖链组成，其中7种为此前未报道过的。通过位点决定性片段离子，我们有信心将5个O-糖基化位点精确到单个残基水平，另外3个位点的定位则基于IMPa的切割特异性及相关的糖肽证据得到初步确定。通过特征性的色谱和裂解特征，我们可以区分不同的糖链结构异构体和氨基酸位置异构体，同时还观察到了可重复的脯氨酸导向裂解模式，为肽段和糖肽的特征分析提供了进一步的支持。总体而言，这些研究结果为未来在IgA相关疾病中开展基于结构信息的生物标志物研究提供了有力的分析框架。
引言
O-连接糖基化是一种重要的翻译后修饰，可调控蛋白质的结构、稳定性及生物学功能[1]、[2]、[3]。免疫球蛋白A1（IgA1）是黏膜免疫中的关键抗体，其铰链区含有大量的O-糖基化修饰，且该区域富含丝氨酸和苏氨酸残基，这些残基可作为糖基化位点[4]、[5]、[6]。IgA1的异常O-糖基化，尤其是半乳糖缺乏型IgA1（Gd-IgA1）水平的升高，是IgA肾病的重要致病因素，同时也与多种炎症性和恶性疾病有关[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]。
尽管已有大量研究，但要对IgA1铰链区的O-糖基化进行具有位点特异性且结构清晰的分析仍然面临挑战[15]、[16]、[17]。以往的大多数研究都是通过分析较长的胰蛋白酶水解糖肽来进行的[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]，并且常常使用神经氨酸酶处理以简化谱图解读，但这反而掩盖了糖链的真正复杂性。此外，O-糖基化位点的高度聚集、巨大的微观差异、糖肽含量低以及离子化效率不佳，这些都使得难以准确确定糖链结构和具体位点[25]。因此，目前对于IgA1铰链区O-糖基化的全面且结构清晰的解析仍然十分有限。
近年来，O-糖蛋白组学方法的进步为克服这些难题带来了新的机遇。铜绿假单胞菌的免疫调节金属蛋白酶（IMPa）是一种O-糖蛋白酶，它能选择性地切割O-糖基化修饰后的丝氨酸和苏氨酸残基的N端[26]。当IMPa与胰蛋白酶消化相结合时，相较于传统的胰蛋白酶消化方法，它能产生更短的糖肽，同时还能保持糖链结构的完整性，从而降低分析复杂度，并提升与质谱分析的兼容性[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]。
高分辨率质谱技术的进步进一步推动了O-糖蛋白组学的全面分析发展[33]。具体而言，Orbitrap Astral平台具备较高的数据采集速度和灵敏度，可快速进行大规模的高能碰撞解离分析；而Orbitrap Eclipse平台则通过采用HCD产物依赖的电子转移/高能碰撞解离技术，能够生成有价值的糖链和肽段衍生片段离子，从而帮助精准定位糖基化位点[34]、[35]、[36]、[37]、[38]、[39]。
在此，我们提出了一种集成分析工作流程，将IMPa/胰蛋白酶双酶消化与Orbitrap Astral和Orbitrap Eclipse平台上的HCD及HCD-pd-EThcD裂解技术相结合，用于全面分析IgA1铰链区的O-糖基化情况。通过降低糖肽的复杂性、保留糖链的天然结构，并整合这些协同的裂解方式，该方法能够实现对IgA1的高可信度、位点特异性的O-糖蛋白组学分析，同时也为分析高糖基化蛋白中结构复杂的O-糖形式提供了分析框架。
章节节选
材料
人血清IgA、碘乙酰胺、二硫苏糖醇、尿素以及三羟甲基氨基甲烷盐酸盐均购自Sigma-Aldrich公司（美国密苏里州圣路易斯市）。PNGase F和O-糖蛋白酶（IMPa）则从New England Biolabs公司（美国马萨诸塞州伊普斯威奇市）购买。甲酸（LC-MS级）购自Macklin公司（中国上海），乙腈（LC-MS级）则来自Merck KGaA公司（德国达姆施塔特）。测序级胰蛋白酶则由Promega公司（美国威斯康星州麦迪逊市）提供。超滤装置
IgA1铰链区O-糖基化位点特异性分析的工作流程
为了对IgA1铰链区的O-糖基化进行位点特异性的分析，我们采用了胰蛋白酶与O-糖蛋白酶IMPa的双酶消化策略，作为集成分析工作流程的一部分（见图1）。由于富含脯氨酸的铰链区缺乏胰蛋白酶的切割位点（精氨酸或赖氨酸），因此仅用胰蛋白酶消化会生成一条长度为38个氨基酸的糖肽（见图1a、c），在该糖肽的17个氨基酸长的核心铰链区内存在多达9个潜在的O-糖基化位点。
结论
在本研究中，我们开发了一种集成工作流程，将IMPa辅助的双酶消化与HCD及HCD-pd-EThcD裂解技术相结合，用于对人类IgA1铰链区的O-糖基化进行位点特异性的分析。通过这种方法，我们鉴定出了103种独特的O-糖肽和13种O-糖链组成，其中包括7种在血清IgA1中此前未被报道过的类型，同时也有实验数据支持所有已报道或推测存在的O-糖基化位点。
CRediT作者贡献说明
孟六轩：论文撰写——初稿、软件应用、方法设计、实验实施、正式分析、数据整理、概念构建。辛志强：可视化处理、结果验证、方法设计、正式分析。吴晨晨：结果验证、方法设计、正式分析。彭瑶：资源提供、实验实施。邱佳琪：资源提供、实验实施。米建宁：结果验证、正式分析。刘亮：资源提供、项目管理。陈安琪：论文撰写——审阅与编辑、项目监督、方法设计、概念构建。
利益冲突声明
? 作者声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
本研究得到了以下机构的支持：中国国家自然科学基金（项目编号：82230119和82574728）；中药广东省实验室（项目编号：HQL2024PZ020和HQL2025SU013）；国家中医药管理局创新团队与人才培育项目（项目编号：ZYYCXTD-D-202403）；广东省基础与应用基础研究基金（项目编号：2024A1515012099）；以及广东省“珠江”人才计划项目（项目编号：
Sixuan Meng|Zhiqiang Xin|Chenchen Wu|Yao Peng|Jiaqi Qiu|Jianing Mi|Liang Liu|Anqi Chen|Hudan Pan|Jingrong Wang
中国中医科学院广安门医院中药广东省实验室，中国广州
