使用加权基因共表达网络分析鉴定可能与奶牛泌乳性状相关的关键候选基因

《Veterinary Sciences》：Identification of Key Candidate Genes Potentially Associated with Lactation Traits in Dairy Cows Using Weighted Gene Co-Expression Network Analysis

　　

泌乳性状是评估奶牛生产性能和乳制品经济效益的重要指标。鉴定潜在调控基因对于阐明泌乳的分子机制和促进分子育种至关重要。本研究旨在通过整合8头荷斯坦奶牛的原代乳腺上皮细胞（BMECs）转录组表达谱与泌乳表型数据，识别可能与奶牛泌乳性状相关的候选基因和调控通路。研究人员使用加权基因共表达网络分析（WGCNA）构建了基因共表达网络。鉴定了与泌乳性状相关的共表达模块，并通过整合基因显著性、模块成员度、功能富集分析、随机森林分析、基因-表型关联分析、单基因基因集富集分析（GSEA）、ROC曲线分析和组织表达谱进一步筛选候选基因。四个共表达模块，即MEdarkturquoise、MEsteelblue、MEbrown和MEskyblue3，与泌乳性状显著相关（p < 0.05）。这些模块中的基因主要富集于核糖体生物发生、蛋白质翻译、细胞周期、氧化磷酸化和PI3K-Akt信号通路等生物学过程和通路，这些过程可能参与泌乳调控。通过多策略交叉筛选，最终鉴定出四个候选基因：MDM2与每日产奶量（DYM）相关，RPL37A与总乳固体（TMS）相关，SLC25A25和CCNE2与乳脂率（MFP）和脂蛋比（FPP）相关。逆转录定量实时PCR（RT-qPCR）验证显示，MDM2和RPL37A在乳腺组织中相对高表达，提示它们可能参与奶牛泌乳相关的生物学过程。这些发现为泌乳性状分子机制的进一步研究提供了潜在的候选调控因子和理论支持；但其功能作用仍需通过体外和体内实验进一步验证。

**研究背景与意义**
随着生活水平提升和乳制品需求增长，提高奶牛产奶量和乳品质成为现代乳业高质量发展的关键目标。泌乳性状（如产奶量、乳脂率、乳蛋白率等）是评估奶牛生产性能和经济效益的重要指标，受遗传和环境因素共同调控。尽管已有研究揭示了部分基因（如DGAT1的K232A突变）与泌乳性状的关联，但泌乳性状作为典型复杂数量性状，受多个微效基因及基因-基因互作累加效应调控，传统单基因方法难以系统揭示其遗传基础。因此，有必要识别潜在候选基因，探索泌乳调控网络。加权基因共表达网络分析（WGCNA）是一种系统生物学方法，可基于基因表达谱构建共表达网络，识别与目标性状相关的功能模块和枢纽基因，已在猪、羊等经济性状研究中广泛应用，但在奶牛泌乳性状研究中仍有不足，如聚焦于有限性状或仅基于差异表达、模块成员度等单一标准筛选候选基因。本研究整合多策略分析框架，旨在提高候选基因筛选的可靠性和生物学可解释性，为分子育种提供候选标记。论文发表在《Veterinary Sciences》。

**关键技术与方法**
研究人员从245头第二胎次、泌乳中后期（150–220天）荷斯坦奶牛中，基于乳脂率极端差异选择8头个体（年龄29–31月龄，相同饲养管理条件），采集其原代乳腺上皮细胞（BMECs）进行转录组测序，并匹配泌乳表型数据（包括每日产奶量DYM、乳脂率MFP、乳蛋白率MPP、总乳固体TMS等）。主要技术方法包括：①WGCNA构建基因共表达网络并识别与泌乳性状显著相关的模块；②基于基因显著性（GS）和模块成员度（MM）筛选枢纽基因，并结合蛋白-蛋白互作（PPI）网络分析（通过STRING数据库和Cytoscape计算局部平均连接度LAC）及模块内连通性（TOM）筛选核心基因；③随机森林回归分析评估基因特征重要性；④基因-表型关联分析（Pearson相关）；⑤单基因基因集富集分析（GSEA）探索潜在功能通路；⑥ROC曲线分析评估候选基因区分高/低表型组的能力；⑦RT-qPCR检测候选基因在7种组织（乳腺、心、肝、脾、肺、卵巢、子宫）中的表达模式。

**研究结果**
**3.1 通过WGCNA筛选枢纽基因和核心候选基因**
经质量控制后保留10,568个基因，选择软阈值14（标度拟合指数R²=0.78）构建拓扑重叠矩阵（TOM），通过层次聚类和动态树切割识别43个原始模块，合并后获得22个独立共表达模块。模块-性状相关性分析表明：MEdarkturquoise模块与MFP、MFY、MPP、TMS显著负相关（p<0.05）；MEsteelblue模块与DYM负相关，与MFP和FPP正相关（p<0.05）；MEbrown模块与DYM正相关；MEskyblue3模块与MLP正相关。基于GS≥0.4和MM≥0.9，在四个模块中分别筛选出55、122、106、31个枢纽基因，并选择各模块中连通性前50的基因作为核心候选基因。

**3.2 核心基因鉴定**
利用STRING数据库构建PPI网络，计算LAC值，保留前50%LAC值基因，与GS-MM枢纽基因及连通性前50基因交集，得到MEdarkturquoise模块6个、MEsteelblue模块35个、MEbrown模块23个、MEskyblue3模块13个核心基因。

**3.3 核心基因功能富集分析**
KEGG和GO富集分析（校正p<0.05）表明，核心基因主要涉及蛋白质合成与降解、线粒体能量代谢、氧化应激调控、免疫应答和细胞周期等过程。MEbrown模块富集于核糖体翻译、泛素介导的蛋白质降解及细胞代谢信号通路；MEskyblue3模块富集于免疫炎症、细胞外基质组织及线粒体/胞质组分；MEdarkturquoise模块富集于核糖体功能、氧化磷酸化、谷胱甘肽代谢、过氧化物酶体及氧化还原调控；MEsteelblue模块富集于DNA损伤修复、细胞周期调控、细胞衰老、泛素介导的蛋白水解、脂肪酸生物合成及线粒体能量代谢。

**3.4 机器学习与相关性分析**
基于随机森林算法对核心基因构建泌乳表型预测模型，按特征重要性排序。在MEbrown模块中，RPS26、ATP6V0A1、NACA、SETD7、MDM2、UXT贡献率>10%；MEskyblue3模块中PARP14和IFI44L贡献率>15%；MEdarkturquoise模块中RPL37A和GSTK1贡献率>19%；MEsteelblue模块中PIGO和NUP35贡献率>10%。结合富集结果和文献报道，进一步筛选出9个候选基因（MMS22L、CCNE2、SLC25A25、UXT、NACA、PIGO、MDM2、RPL37A、NUP35），这些基因与多个泌乳性状显著相关（p<0.05）。

**3.5 单基因GSEA**
对9个候选基因进行单基因GSEA，排除UXT和PIGO（无重叠富集）。剩余7个基因显著富集于特定GO和KEGG通路：MDM2富集于“泛素依赖性蛋白分解过程的正调控”、“泛素蛋白连接酶活性”及内分泌抵抗、FoxO、PI3K-Akt信号通路；NACA富集于“蛋白质靶向膜”；RPL37A富集于核糖体结构和翻译；NUP35富集于核质和相同蛋白结合；CCNE2富集于G1/S期转换和细胞周期通路；MMS22L富集于同源重组双链断裂修复；SLC25A25富集于细胞呼吸和ATP代谢。

**3.6 候选基因PPI分析**
构建9个候选基因的PPI网络（置信度≥0.7，最多20个互作因子）。与FPP相关的PIGO、CCNE2、MMS22L、SLC25A25中，PIGO互作蛋白属PIG家族（参与GPI合成），SLC25A25互作蛋白MSTO1为线粒体功能蛋白，CCNE2互作蛋白RBL1和E2F5-2参与细胞周期和转录调控。与DYM相关的NUP35、NACA、MDM2、UXT中，NACA和MDM2通过RPL5/RPL5-2间接互作，NUP35主要与核孔复合体家族互作。与MFP相关的PIGO、CCNE2、SLC25A25互作模式与FPP类似。RPL37A（与TMS相关）互作蛋白均属RPL家族。

**3.7 ROC曲线与关键候选基因筛选**
对候选基因进行ROC分析：CCNE2（AUC=0.938, 95% CI: 0.764–1.000）和SLC25A25（AUC=0.938, 95% CI: 0.764–1.000）区分高/低MFP组能力优于PIGO（AUC=0.875）；RPL37A对TMS高/低组区分能力中等（AUC=0.875）。综合GSEA、PPI和ROC分析，最终确定四个关键候选基因：MDM2（可能参与DYM调控）、RPL37A（可能参与MFP和TMS调控）、SLC25A25和CCNE2（可能共同参与MFP调控）。

**3.8 RT-qPCR验证**
检测四个候选基因在7种组织中的相对表达水平：MDM2在乳腺中表达显著高于心、肺、卵巢和子宫（p<0.05）；RPL37A在脾脏中高表达，乳腺、肝和卵巢中表达与脾脏无显著差异，相对较高；SLC25A25在肝脏中表达显著高于其他组织；CCNE2在肺中表达最高（p<0.05），心、子宫中表达中等，乳腺中表达低。RT-qPCR结果证实了候选基因的组织表达模式，为生物学相关性提供初步实验支持。

**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究通过WGCNA识别出四个与泌乳性状相关的共表达模块，功能富集分析表明模块基因主要参与核糖体功能、细胞周期、氧化磷酸化及PI3K-Akt信号通路（该通路是调控BMECs增殖和乳脂合成的经典通路）。通过多策略整合筛选，MDM2、RPL37A、SLC25A25和CCNE2被确定为关键候选基因。MDM2作为E3泛素连接酶，先前报道与产奶量相关，单基因GSEA提示其参与泛素介导的蛋白水解和细胞周期，RT-qPCR显示其在乳腺中相对高表达，可能通过影响细胞周期和蛋白质周转参与泌乳。RPL37A编码60S核糖体亚基成分，在乳腺中表达较高，可能参与BMECs蛋白质合成，与乳蛋白和总乳固体相关。SLC25A25属于线粒体转运蛋白家族，在肝脏中高表达，可能通过系统能量代谢或肝脏脂质代谢间接影响乳脂性状。CCNE2调控G1/S期转换，尽管在乳腺中表达较低，但可能通过细胞周期通路与泌乳相关，其PPI网络中的RBL1和E2F成员提示与转录调控有关。研究局限性包括样本量较小、候选基因功能需进一步验证（体外/体内实验）、独立大样本人群确认等。

**结论**
本研究整合WGCNA、生物信息学分析、机器学习排序和RT-qPCR组织表达分析，识别了荷斯坦奶牛泌乳性状相关的潜在候选基因。具体而言，计算分析表明MDM2与DYM相关，RPL37A与TMS相关，SLC25A25和CCNE2与MFP相关。功能富集结果提示这些基因可能参与乳成分合成、线粒体能量代谢和细胞周期相关通路。RT-qPCR分析确认了这些候选基因的组织表达模式，为其生物学相关性提供了初步支持。总之，这些发现有助于识别泌乳相关共表达模块，并突出MDM2、RPL37A、SLC25A25和CCNE2作为未来功能研究的候选基因。需要在更大独立人群中进行进一步验证，并通过体外和体内实验阐明其在泌乳性状中的潜在作用，评估其在奶牛分子育种中的应用可能性。