《Aquaculture》：Development of recombinant subunit vaccines against Flavobacterium covae and Flavobacterium columnare in grass carp (Ctenopharyngodon idellus): Evaluation of protective efficacy and antibody immune response
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摘要由黄杆菌属细菌引起的柱状菌病对全球淡水水产养殖业构成严重威胁，尤其是对中国草鱼产业而言。为制定有效的预防措施，通过对该菌MU-04菌株的免疫蛋白质组学分析，筛选出了10种潜在疫苗抗原。其中两种候选抗原——PorT（sprT）家族蛋白和一种假设蛋白——被成功重组表达、纯化，并在
摘要
由黄杆菌属细菌引起的柱状菌病对全球淡水水产养殖业构成严重威胁，尤其是对中国草鱼产业而言。为制定有效的预防措施，通过对该菌MU-04菌株的免疫蛋白质组学分析，筛选出了10种潜在疫苗抗原。其中两种候选抗原——PorT（sprT）家族蛋白和一种假设蛋白——被成功重组表达、纯化，并在草鱼中检测了其免疫原性和保护效果。使用rPFP和rHP疫苗接种后，草鱼对MU-04菌的相对存活率分别为77.8%和88.9%。值得注意的是，在所测试条件下，这两种重组蛋白都能为草鱼提供完全的交叉保护作用，使其对JX-01菌的存活率也达到100%。酶联免疫吸附试验和免疫荧光分析显示，血清、黏液及组织培养上清液中的特异性IgM抗体水平显著升高，同时黏膜组织中的IgM+细胞也出现明显增殖。这些结果表明，rPFP和rHP是具有潜力的候选抗原，能够在实验环境中引发强烈的系统性和黏膜免疫反应。我们的研究为进一步开发这类疫苗以实现对柱状菌病的广谱防护提供了依据。
引言
柱状菌病是一种常见的淡水鱼类细菌性疾病，由黄杆菌属多种细菌引起，包括柱状黄杆菌、covae黄杆菌、davisii黄杆菌以及奥利罗姆黄杆菌等（LaFrentz等人，2022年）。该疾病在全球范围内都有分布，既会影响野生鱼类，也会危害养殖鱼类，已造成严重的经济损失（Welker等人，2005年；Declercq等人，2013年；Wang等人，2022年）。目前，已有研究表明该疾病可感染多种鱼类，包括草鱼、金鱼、美洲鲶、罗非鱼、鲑鱼等（Decostere等人，1998年；Suomalainen等人，2006年；Soto等人，2008年；Declercq等人，2012年；Declercq等人，2013年）。该疾病的临床表现为过度分泌黏液，鳃部出现黄白色病灶，这些部位正是细菌定植的地方（Declercq等人，2013年）。外部症状还包括背鳍基部部分鳞片脱落，随后出现皮肤溃疡，形成典型的“马鞍形”病灶（Pacha和Ordal，1967年）。
疫苗接种是预防和控制柱状菌病最有效且环保的策略。目前用于预防该疾病的疫苗包括全细胞疫苗和亚单位疫苗。目前市面上唯一的柱状菌病疫苗是一种减毒活疫苗，经浸泡免疫后，可让美洲鲶的相对存活率达到94%（Shoemaker等人，2011年；Mohammed等人，2013年）。在最近的一项研究中，一种由covae黄杆菌制成的灭活疫苗能让草鱼对covae黄杆菌的相对存活率达到71%，同时对柱状黄杆菌也有55%的交叉保护作用（Guo等人，2023年）。Mohamed Sayed等人则利用covae黄杆菌表面暴露的蛋白制备了亚单位疫苗，有佐剂和无佐剂情况下，分别使鲶鱼的存活率达到58.8%和46.2%（Sayed等人，2023年）。
草鱼是中国最重要的淡水养殖物种，年产量超过550万吨（Ding等人，2021年）。在各类细菌性疾病中，由黄杆菌属细菌引起的柱状菌病对草鱼养殖业的可持续发展构成了重大威胁（Thomas和Mohamed，2015年）。最近的流行病学调查表明，中国草鱼的主要致病菌为柱状黄杆菌和covae黄杆菌（Lu等人，2021年；Han等人，2023年）。先前的研究也证实，由covae黄杆菌MU-04菌株制成的灭活疫苗能够为草鱼提供针对这两种细菌的免疫保护（Guo等人，2023年）。从工业化生产的经济角度考虑，若使用黄杆菌作为全细胞疫苗，则需要在大规模发酵过程中进行较长时间的培养，这不仅会增加时间成本，还会提升生物安全风险（Gao和Gaunt，2016年）。因此，筛选具有保护作用的抗原并开发亚单位疫苗，成为实现高效免疫保护并降低生产成本的关键策略（Pollet等人，2021年；Wang等人，2024年）。基于此，本研究从covae黄杆菌MU-04菌株中筛选出了10种有望用于制备亚单位疫苗的蛋白质。其中两种候选抗原——PorT（sprT）家族蛋白和一种假设蛋白——被选用于在大肠杆菌中重组表达。研究人员进一步评估了这两种重组蛋白作为亚单位疫苗对covae黄杆菌和柱状黄杆菌的保护效果，并同步检测了接种后的抗体反应情况。
内容节选
鱼类与细菌菌株
草鱼（平均体长14厘米，体重23±5克）购自中国广东省云浮市的新兴苗种场。实验前，这些鱼在带充氧装置的流动系统中适应至少两周，并每天喂食商业饲料。根据之前的研究（Lu等人，2021年；Guo等人，2023年），随机选取5条鱼进行病原体检测。具体而言，从每条鱼的血液、肝脏和脾脏中分离出细菌样本。
候选抗原的鉴定
首先从covae黄杆菌MU-04菌株中提取外膜蛋白，再利用蛋白A磁珠以及用该菌株免疫过的草鱼抗血清通过免疫沉淀法分离出具有免疫原性的蛋白。SDS-PAGE分析显示，共有三条明显的蛋白带，分子量分别约为250千道尔顿、70千道尔顿和25千道尔顿（见图1）。其中分子量为70千道尔顿的蛋白带最为显著，被取出用于LC-MS/MS分析，以便筛选出更具免疫原性的成分；而其他较弱的蛋白带则被排除，以避免非特异性结合带来的干扰。
讨论
重组亚单位疫苗因能够实现精准的免疫靶向作用，同时避免活病原体或核酸疫苗可能带来的风险，而备受研究关注（Sayed等人，2023年；Yang等人，2023a、2023b年）。找到具有高免疫原性的保护性抗原，是亚单位疫苗研发的核心所在（Trung Hieu等人，2021年）。虽然反向疫苗学为抗原筛选提供了一种系统化的方法，但预测出的候选抗原仍需进一步验证。
CRediT作者贡献说明
何忠宁：原文撰写。韩睿：方法设计、实验实施。吴慧成：实验实施。丹学明：项目监督、管理以及研究构思。李彦伟：文章审阅与编辑、项目监督、管理以及研究构思。莫泽全：文章审阅与编辑、资源协调、方法设计、实验实施以及研究构思。
利益冲突声明
所有作者均声明，本研究中不存在任何利益冲突。
致谢
本研究得到了广州市科技计划项目（项目编号：2023B04J0172）以及南沙华南农业大学渔业研究所专项科研基金（项目编号：NSYYKY202303）的支持。
Zhongning He|Rui Han|Huicheng Wu|Xueming Dan|Yanwei Li|Zequan Mo
中国广东省港澳地区海洋生物资源保护与利用高校联合实验室，华南农业大学海洋科学学院，广州510642
