检测条件很重要：培养板材质和pH值会影响斑马鱼胚胎对锂的反应

《Aquatic Toxicology》：Assay conditions matter: plate material and pH alter lithium responses in zebrafish embryos

　　

摘要

由于锂在可充电电池中的广泛应用，其对锂的需求不断上升，这引发了人们对其进入水生环境的担忧。在水生测试条件下，锂的生物利用度和毒性可能受到水质以及pH值和实验容器材料等实验条件的影响。本研究依据经合组织测试指南236——鱼类胚胎毒性测试，探讨了培养板材料和pH值对斑马鱼胚胎中锂浓度以及发育、致畸和行为反应的影响。实验在未经处理的（pH 7.6）和酸化条件（pH 6）下的聚苯乙烯和聚丙烯培养板上进行。此外，还进行了锂物种建模，以评估化学物种可能发生的变化。在实验中未观察到暴露的幼鱼出现发育或致畸变化。然而，在较高浓度下，聚丙烯培养板中的锂回收率更高，这可能是因为聚丙烯表面的惰性更强。基因表达分析进一步揭示了材料差异带来的分子反应，表明在低浓度下存在转录水平的生物学反应。行为分析显示，在较高锂浓度下，鱼的运动反应减弱，且在pH 6条件下这种效应更为明显。物种建模结果表明，在所有测试条件下，锂的物种分布基本保持不变，这说明与pH值相关的效应不太可能是由锂物种的变化引起的。在所有实验条件下，无论培养板材料或pH值如何，都会形成类似蛋白质的化合物，这表明这些化合物是在原位生成的，且在结合大分子锂方面作用有限。总体而言，我们的研究结果表明，实验材料和pH值会影响毒性测试的结果，因此在设计水生毒性测试时需慎重考虑这些因素。

引言

锂是地球上唯一可以追溯到宇宙大爆炸的金属。天然状态下的金属锂极为罕见，且会与水发生剧烈反应，生成氢气和高碱性的溶液。过去十年中，由于锂在电池中的广泛应用，其需求量大幅增加。在自然界中，锂是最轻的碱金属，仅以阳离子形式存在，要么嵌入矿物中，要么以水溶液中的自由一价离子Li⁺形式存在（Kj?lholt等人，2003年；Tarascon，2010年）。锂的半径仅为65-75皮米，因此具有很高的电荷密度，进而导致强烈的水合现象。由于较高的电荷密度会带来更高的放热水合焓，所以Li⁺可被视为水中的持久性化合物（Kavanagh等人，2017年；Persson，2010年）。锂通过多种途径进入水生系统和土壤，包括冶炼、采矿、污水处理设施产生的药物残留以及锂离子电池的处置。全球对锂离子电池需求的不断增加以及缺乏有效的回收方法，将会加剧锂污染，尤其是在水生环境中，因为用于回收钴和镍等金属的简单工艺往往会使锂残留在炉渣中（Hantanasirisakul和Sawangphruk，2023年）。

随着废弃物处理和回收规模的扩大，预计会有更多锂进入水生系统，这一情况引发了人们的担忧，因为目前人们对锂的生物效应了解甚少（Aral和Vecchio-Sadus，2008年）。此外，人们已经提出了淡水中的锂环境质量标准：短期暴露限为89.6微摩尔/升，标准条件下的限值为2.19微摩尔/升（Oliver和Hewett，2024年）。另外，生态毒理学效应在很大程度上取决于所测化合物的化学状态（即物种形态），并且会受到许多（物理）化学参数的影响，其中pH值、氧化还原电位、温度、无机离子的络合作用以及有机物的组成是最为重要的参数（Donard，2001年；Paquin等人，2002年）。决定金属物种形态的两个主要因素是络合化合物的形成以及金属在固体载体上的吸附作用（Domingos等人，2015年）。对于微量元素来说，形成化学计量比的固体较为罕见，硫化物形成元素或许是个例外。不过，硫化锂（Li₂S）在水中极易溶解，会水解生成氢氧化锂（LiOH）和硫化氢（H₂S）（Hiesgen等人，2013年）。目前关于锂与环境中的天然有机物质的相互作用研究还很少。不过，由于锂具有药用价值，它可能会与天然存在的功能性分子基团发生络合。原则上，络合化合物的形成会降低有毒金属物种的活性，从而使金属的溶解度增加或使其固定在特定位置（De Paiva Magalh?es等人，2015年）。虽然元素物种形态会改变暴露浓度，进而影响其生物利用度，但这种因素对毒性测试结果的影响却很少被研究。此外，气候变化还将从根本上影响生物地球化学过程，比如预计会导致淡水酸化加速（Leduc等人，2013年）。因此，有必要根据预期的环境变化，研究新的毒理学评价指标。对于锂来说，由于其强烈的水合性和较低的络合能力，其移动性较高。不过，锂与表面的相互作用以及pH值变化对其吸附作用的影响目前仍不明确。

在生态毒理学中，斑马鱼胚胎常被用作锂毒性研究的模型生物（Nery等人，2014年；Siebel等人，2014年）。由于斑马鱼体型小、世代周期短、后代数量多、饲养成本低且易于操作，因此被广泛用于毒性测试（Basnet等人，2019年）。经合组织制定的指南中就有一个典型的应用示例，该指南建议在毒性筛查中使用标准化的水和聚苯乙烯制成的24孔培养板（OECD，2013年）。不过，与聚丙烯这类更惰性的聚合物相比，聚苯乙烯对大多数金属的吸附能力较强，且吸附能力会随着可用表面积的增加而按物种特性发生变化（Barus等人，2021年）。金属在聚合物上的吸附取决于pH值、吸附容量、浓度以及聚合物的亲水性。金属与聚合物之间的相互作用可以是离子交换、静电吸引或螯合作用等。吸附机制可以用朗缪尔吸附模型来描述，该模型假设为单层吸附；弗罗因德利希模型则用于描述多层吸附；雷德利克-彼得森等温线则结合了这两种模型；而坦姆金等温线则考虑了间接相互作用。哪种模型最能准确描述这些相互作用在很大程度上取决于聚合物的种类（Brirmi等人，2024年）。对于金属在微塑料颗粒上的吸附机制，也有多种理论，这些机制取决于金属元素、其物种形态以及聚合物颗粒的性质（Maity等人，2021年）。不过据我们所知，这些机制在锂的研究中尚未得到系统性的验证。

尽管锂的环境重要性日益凸显，但实验条件如pH值和暴露条件对其毒理学效应的影响仍不十分清楚。众所周知，环境参数会改变金属的物种形态、其在表面的吸附情况，进而影响毒性试验中离子的生物利用度。然而，在生态毒理学研究中，这些因素很少被系统地加以评估。因此，本研究旨在探究不同的pH值以及培养板材料（聚苯乙烯和聚丙烯）对以下方面的影响：（1）暴露溶液中锂浓度随时间的变化；（2）根据经合组织236标准所观察到的形态学变化；（3）斑马鱼胚胎的亚致死效应，包括行为改变以及与眼睛和神经发育相关的基因表达变化。

章节节选

基于pH值的锂物种建模

为了确定对锂浓度影响最小的标准培养基，我们以常用的FET培养基——ISO 7346-1标准水、丹尼尔溶液以及汉克缓冲液的一般化学成分作为输入数据，其中实验中加入了最高浓度的锂（12.8毫摩尔/升），进而使用Visual Minteq软件对饱和条件以及溶解物种的分布情况进行建模（Gustafsson，2023年）。该软件最初是基于与大气气体达到平衡的条件构建的数据库，然后用于进行建模。

锂的生物地球化学模型

在本研究的初始条件下，即加入本研究中所使用的最高浓度的Li⁺离子时，溶液中的主要成分是游离的水合Li⁺离子，氯化物（LiCl）和硫酸盐（LiSO₄^-）络合化合物的贡献相对较小。在所选的pH值范围内，锂形成碳酸氢盐和碳酸盐络合化合物的可能性很低。根据饱和条件，也不太可能形成化学计量比的固体（见图1）。对于任何一种培养基来说，

讨论

目前尚未发现锂具有任何生理功能，因此被认为是一种非必需元素（Léonard等人，1995年）。尽管锂具有药理活性，但其环境毒性相对较低。不过，其生态影响仍不十分清楚（Aral和Vecchio-Sadus，2008年；Kavanagh等人，2017年）。我们的研究结果表明，pH值等环境参数以及培养板材料等实验设计因素，都会影响锂对斑马鱼的亚致死效应。

结论

本研究表明，实验条件，尤其是培养板材料和pH值，会影响锂在斑马鱼胚胎毒性测试中的暴露程度及其亚致死效应。在聚丙烯培养板上进行实验时，锂暴露所引发的行为反应更为明显。由于聚丙烯培养板中的锂回收率高于聚苯乙烯培养板，因此培养板材料的吸附差异可能导致了观察到的行为差异。

pH值6与7.6之间的差异为

资金来源

这项工作属于EnForce项目的一部分，由瑞典知识基金会提供资助（项目编号201660019），同时部分资金来自欧洲联盟“地平线2020”研究与创新计划下的MSCA项目CoLiBRI（项目编号101069005），以及由瑞典知识基金会资助的SEASON项目（项目编号20240010）。

作者贡献

JKG、FB和SK共同撰写了初稿，所有作者都参与了意见贡献。JKG和FB负责开展实验，JKG负责分析FET数据、行为数据以及浓度数据。FB与SHK一起进行qPCR实验并分析相关数据，JKG和SK则负责生物地球化学建模。VS负责金属定量分析，SK负责高效液相色谱分析。SHK与SK一起构思了研究方案，并听取了所有作者的意见。SHK还负责对手稿进行审阅和编辑。所有作者均已批准最终版本的稿件。

CRediT作者贡献说明

Jana K. Geuer：概念构建、方法设计、实验实施、定量分析、数据整理、可视化处理、初稿撰写。

Frederik Bu?mann：方法设计、实验实施、定量分析、可视化处理、初稿撰写。

Stefan Karlsson：概念构建、方法设计、定量分析、实验实施、初稿撰写。

Viktor Sj?berg：实验实施、定量分析、稿件审阅与编辑。

Steffen H. Keiter：概念构建、研究监督、资金筹集，

CRediT作者贡献详细说明

Jana K. Geuer：稿件审阅与编辑、初稿撰写、可视化处理、项目管理工作、实验实施、数据整理。Frederik Bu?mann：稿件审阅与编辑、初稿撰写、可视化处理、实验实施、数据整理。Stefan Karlsson：稿件审阅与编辑、初稿撰写、实验实施、数据整理、概念构建。Viktor Sj?berg：稿件审阅与编辑、实验实施、数据整理。Steffen H. Keiter：稿件审阅与编辑，

Jana K. Geuer|Frederik Bu?mann|Stefan Karlsson|Viktor Sj?berg|Steffen H. Keiter

瑞典厄勒布鲁大学科学与技术学院，厄勒布鲁