植物源杀虫剂候选物三叶 Combretum trifoliatum 及其主要成分樟脑对非目标水生生物的安全性：斑马鱼中的性别差异性神经毒性、胆碱能功能紊乱以及在水中的持久性

《Aquatic Toxicology》：Non-target aquatic safety of the botanical insecticide candidate Combretum trifoliatum and its major constituent camphor: Sex-dimorphic neurotoxicity, cholinergic disruption, and water persistence in zebrafish

　　

摘要

Combretum trifoliatum Vent.是一种具有潜力的植物源杀虫剂，但其环境归趋以及对非目标水生生物的安全性尚未明确。本研究以成年斑马鱼（Danio rerio）为实验对象，评估了该植物乙醇提取物及其主要成分樟脑的急性毒性、神经行为干扰、酶解毒作用以及在水中的持久性。高效液相色谱分析显示樟脑是该提取物中的主要成分，占比为24.66%（重量百分比）。粗提物的急性毒性较低（96小时共同LC50值为193.4毫克/升），而樟脑的毒性则显著更高（96小时共同LC50值为29.00毫克/升）。亚致死剂量暴露会导致性别差异性的神经行为变化：雄性斑马鱼表现出不活跃状态，而雌性则表现出过度活跃，且在空间偏好和游泳模式上存在性别特异性差异。这些行为变化与胆碱能系统功能紊乱有关，因为雄性斑马鱼中的乙酰胆碱酯酶被抑制，而雌性则其活性上升。谷胱甘肽S-转移酶活性保持不变，而羧酸酯酶仅在接触粗提物的雌性斑马鱼中产生选择性激活，这表明代谢反应会受到物质载体环境的影响。在水中的持久性测试显示，樟脑的降解过程存在约13天的明显延迟期，降解率极低（超过96%仍保留原有浓度），之后进入快速一级衰减阶段，延迟期后的半衰期为5.80天，整体DT50值为18.57天。尽管该物质的急性致死率较低，但由于其在环境中的长期存在以及性别差异性的神经行为和酶学影响，因此在广泛使用之前需要进行严格的风险评估。

引言

合成杀虫剂的过度使用引发了人们对环境污染、非目标生物毒性以及害虫抗药性产生的广泛担忧。植物源杀虫剂逐渐被视为综合害虫管理策略中的重要辅助手段，因为它们通常由多种生物活性成分组成，在环境中更易分解，且可能具有不同的作用机制（Fajriah等人，2016；Mendoza-Poudereux等人，2017）。然而，植物源杀虫剂并非天然就安全无害（Isman，2006）。其活性成分可能具有强烈的生物效应，非目标生物——尤其是受农业废水影响的水生生物——可能因此遭受伤害，这一点在环境风险评估中至关重要。

Combretum trifoliatum Vent.属于 Combretaceae 科，是一种广泛分布于东南亚的药用植物，在泰国传统医学中也有应用（Neamsuvan等人，2015；Saensouk等人，2025）。近年来，它因可作为植物源杀虫剂的潜在来源而受到关注。先前的研究已表明，该植物的叶片和枝条的乙醇粗提物，以及其中的两种主要活性成分樟脑和芹菜素，对多种农业害虫具有很强的杀虫效果。对于秋粘虫（Spodoptera frugiperda），该粗提物展现出很强的幼虫杀伤力（Changkeb等人，2023）；同时对褐飞虱（Nilaparvata lugens）也有很高的毒性（Kumrungsee等人，2025）。综上所述，C. trifoliatum有望成为一种有效的植物源害虫控制手段。

不过，要判断C. trifoliatum是否真的代表了新的突破，还是仅仅属于现有的植物源杀虫剂范畴，就需要将其安全性与其他Combretaceae科植物以及同类植物源杀虫剂进行比较。Combretaceae科的许多物种，如Combretum erythrophyllum和Terminalia catappa，含有多种单宁、黄酮类和萜类化合物，这些成分具有广谱的抗菌和杀虫作用（Masia等人，2026；McGaw等人，2001；Yakubu等人，2020），但对非目标水生生物的毒性却有所不同（Hashim等人，2020；McGaw等人，2001；Meneses等人，2020）。通过研究粗提物及其单独成分，我们可以了解整个植物基质是否会减弱或增强其中活性成分对非目标生物的毒性。

鉴于其主要活性成分樟脑和芹菜素的特性，C. trifoliatum在毒理学研究方面具有特殊意义（Changkeb等人，2023；Kumrungsee等人，2025）。樟脑是一种易挥发的单萜酮，常见于多种杀虫精油中，具有很强的接触毒性、驱避效果，能够抑制多种储藏产品害虫的发育，同时还具有出色的熏蒸效果（Chen等人，2018；Obeng-Ofori等人，1998）。然而，正是这种易挥发性、化学反应性和生物活性，使得这些成分在杀死目标害虫的同时，也可能对非目标水生生物造成危害。具体而言，樟脑在无脊椎动物和脊椎动物中都具有已得到证实的神经活性（Du等人，2021；Somade，2023；Yim等人，2014）；而芹菜素作为一种黄酮类化合物，则在多种生物系统中具有抗氧化、细胞毒性以及调节酶活性的作用（Fajriah等人，2016）。

尽管有越来越多的证据表明C. trifoliatum具有杀虫效果，但其环境风险方面的研究仍然存在诸多空白。目前关于该植物粗提物及其主要成分在水生脊椎动物中的急性毒性及亚致死效应的研究很少，关于鱼类行为反应和酶解毒机制的数据更是几乎空白。此外，人们普遍认为天然物质必然会在环境中快速降解，但这一观点在科学上并未得到充分证实。由于不同制剂、当地水质以及特定化学结构都会影响物质的持久性，C. trifoliatum提取物在水中的环境归趋，包括其持久性和降解动力学，也尚未得到系统研究。为了解决这一问题，我们通过实验室水环境测试，系统研究了提取物中的主要活性成分樟脑的持久性和降解动力学，以此作为预测整个植物提取物环境归趋的参考依据。

在之前的杀虫效果研究中，我们就发现了这些研究空白，因此开展了这项工作，旨在利用水生非目标脊椎动物模型，为现有的功效数据提供初步的生态毒理学评估。为此，我们选择了成年斑马鱼（Danio rerio）作为实验对象，因为它们对环境污染物极为敏感，且能够准确反映致命性和亚致死性毒性反应。虽然传统的生态毒理学研究多采用斑马鱼的胚胎或幼体作为模型，但本研究选择成年斑马鱼是为了能够更全面地评估复杂的综合毒性指标。成年斑马鱼的内分泌、生殖和中枢神经系统已经完全发育成熟，这使得我们能够准确检测出性别差异性的神经行为变化以及特定的酶学生物标志物，而这些在幼体模型中很难准确识别。

为了追踪这些亚致死效应，我们测量了鱼类的行为异常情况以及组织中的特定酶学生物标志物，从而将这些现象与更广泛的生态后果联系起来。具体来说，乙酰胆碱酯酶活性的变化会影响鱼类的运动控制和逃避捕食的能力，而羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶活性的改变则反映出代谢解毒功能的压力，这种压力会损害水生生态系统中的生物长期生理健康、繁殖能力以及种群稳定性。最后，为了全面了解该物质的环境归趋，我们系统研究了提取物中主要活性成分樟脑在水中的持久性和降解动力学。

章节节选

植物材料采集与提取物制备

2024年12月，我们在泰国那空沙旺的玛希隆大学那空沙旺校区采集了C. trifoliatum的叶片和枝条。为减少季节性差异并保证化学成分的均匀性，我们一次性采集了大约20公斤的植物材料。植物种类鉴定工作由泰国曼谷的植物品种保护办公室负责，相关标本（BKF编号203356）已被存放在曼谷植物标本馆中。

将采集到的材料风干后磨成细粉。

样品制备

酶活性的测定是按照Bullangpoti等人（2018）的方法稍作修改后进行的，检测对象为肠道组织匀浆。我们对每种测试物质分别进行了两次独立实验。在每次实验中，鱼类在暴露96小时后被分别取出用于检测。由于两种测试物质在不同性别鱼类体内的LC50值没有显著差异（F检验：C. trifoliatum提取物，p=0.0702；樟脑，p=0.1196），因此两种性别鱼类的LC50值取相同数值。

鱼类的急性毒性及存活情况

96小时急性毒性测试结果显示，斑马鱼在接触C. trifoliatum粗提物或作为其主要成分的樟脑后，都会出现随浓度和时间增加而上升的死亡率。对于粗提物，通过四参数逻辑剂量反应模型的非线性回归分析发现，雄性和雌性斑马鱼的LC50值没有显著差异（p=0.0858），因此两者的共同LC50值为193.4毫克/升（95%置信区间：

讨论

本研究利用成年斑马鱼模型，对C. trifoliatum粗提物及其主要成分樟脑进行了全面的生态毒理学评估。研究结果表明，该物质具有中等程度的急性致死性，同时还会引发显著的、具有性别差异性的亚致死性神经行为和酶学反应，这充分体现了这类植物源物质在水生生物体内的复杂生物相互作用。

结论

虽然C. trifoliatum的乙醇提取物在短期内对水生生物的急性致死风险相对较低，但它并不能被视为对环境无害的物质。无论是粗提物还是其中的主要成分樟脑，都会通过快速破坏胆碱能系统，而非依赖谷胱甘肽介导的氧化途径，对鱼类产生强烈的、具有性别差异性的神经行为和生理毒性。此外，只有粗提物处理组才会出现羧酸酯酶的选择性激活，这一现象进一步凸显了

伦理审批

所有动物实验都是按照帕尧大学动物护理与使用委员会制定的原则和指南进行的（审批编号640104012）。

CRediT作者贡献说明

Saksit Nobsathian：撰写——初稿、方法学、实验研究、概念构建。Sasimar Woraharn：资源提供。Vasakorn Bullangpoti：撰写——审稿与编辑、实验指导、方法学、概念构建。Maroot Kaewwongse：撰写——审稿与编辑、项目管理、方法学、实验研究、概念构建。

Saksit Nobsathian|Sasimar Woraharn|Vasakorn Bullangpoti|Maroot Kaewwongse

泰国那空沙旺市玛希隆大学那空沙旺校区