诱导痰微生物多样性与功能变化在慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者中的宏基因组测序研究：一项横断面研究

《International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease》：Induced Sputum Microbial Diversity and Function Changes in Patients with Acute Exacerbations of Chronic Obstructive Pulmonary Disease by Metagenomic Sequencing: A Cross-Sectional Study

　　

目的 慢性阻塞性肺疾病急性加重期（AECOPD）的潜在发病机制与气道微生物群失调密切相关。目前，基于深度宏基因组测序，缺乏对AECOPD期间微生物物种水平和功能特征以及与宿主临床表型相关性的系统阐述。本研究旨在通过宏基因组二代测序，系统分析COPD患者在稳定期和急性加重期诱导痰样本中微生物组的分类组成和功能变化，并通过宏基因组方法探索其与临床指标的相关性。患者与方法 研究人员共招募了来自中国上海嘉定区中心医院呼吸与危重症医学科的66例COPD患者。其中，经DNA提取和深度宏基因组测序及质量控制后，从47例患者（稳定组17例；急性加重组30例）中获得了49份诱导痰样本。采用生物信息学流程进行物种注释和功能分析，并进行微生物α多样性分析和LEfSe分析以识别差异表达标志物。采用Spearman相关性分析评估微生物/功能特征与一系列临床指标之间的相关性。结果 AECOPD患者痰微生物组的α多样性在物种水平上显著低于稳定期（p < 0.01），且群落结构也发生显著变化。功能注释和比较分析进一步识别出两组间存在显著差异的9个KEGG通路（ko00970、ko04112、ko03420、ko03440、ko03060/ko03070、ko03410、ko04930和ko00680）和1个eggNOG功能类别（M：细胞壁/膜/包膜生物合成）。其中，甲烷代谢等通路在急性加重期下调。结论 本研究揭示了AECOPD患者气道微生物组在物种水平多样性、群落结构和功能代谢方面的显著失调，为发现微生物组中的功能性生物标志物和治疗靶点提供了分子基础。

**论文解读：宏基因组测序揭示慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者诱导痰微生物多样性与功能变化**

**研究背景与问题**

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种以持续性气道炎症和进行性气流受限为特征的慢性疾病，其病程中反复出现的急性加重（AECOPD）是加速肺功能下降、引发呼吸衰竭和死亡的重要原因。尽管支气管扩张剂、糖皮质激素和抗菌药物等现有疗法对AECOPD有一定改善，但患者出院后一年内再入院率高达64%，一年内死亡风险显著（患病率26.2%），因此阐明AECOPD的发病机制并寻找潜在治疗靶点至关重要。既往证据表明，大多数COPD急性加重由病毒和/或细菌感染引起，但仍有约三分之一的加重病因不明。培养依赖研究虽发现流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌和肺炎链球菌等是加重期关键微生物特征，但受限于培养技术，难以全面反映微生物群落。16S rRNA测序技术揭示了COPD加重期呼吸道微生物群失调，但该技术无法识别至物种水平，且不能阐明介导宿主-微生物相互作用的代谢或信号级联等功能通路。因此，亟需采用更高分辨率的宏基因组测序技术，系统分析AECOPD患者气道微生物组的物种水平组成和功能特征，并探索其与宿主临床表型的关联，为预测和靶向微生物干预提供功能性生物标志物。

**研究概述**

本研究由研究人员开展，旨在通过宏基因组二代测序（mNGS）系统分析COPD患者在稳定期和急性加重期诱导痰样本中微生物组的分类组成和功能变化，并探索其与临床指标的相关性。研究人员从中国上海嘉定区中心医院呼吸与危重症医学科连续招募了66例COPD患者，最终纳入47例患者（稳定组17例，急性加重组30例，其中急性加重组进一步分为频繁加重亚组（FE，n=16）和偶发加重亚组（IE，n=14））的49份诱导痰样本进行DNA提取、深度宏基因组测序及生物信息学分析。研究得出以下结论：AECOPD患者痰微生物组在物种水平多样性显著降低，群落结构发生显著改变；功能分析识别出9个KEGG通路和1个eggNOG功能类别在两组间显著差异，其中甲烷代谢通路在加重期下调；这些发现揭示了气道微生物组在物种多样性、群落结构和功能代谢方面的显著失调，为功能性生物标志物和治疗靶点的发现提供了分子基础。该论文发表在《International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用以下关键技术方法（样本队列来源：上海嘉定区中心医院呼吸与危重症医学科）：诱导痰样本收集后，使用QIAamp^? DNA Microbiome Kit提取DNA，在NovaSeq 6000平台上进行宏基因组测序，产生150 bp双端读数。生物信息学分析流程包括：使用Readfq去除低质量读段，Bowtie2比对并去除人类序列，megahit组装非人类读段，MetaGeneMark预测开放阅读框，CD-HIT构建非冗余基因目录。物种分类使用Kraken2和Bracken（基于标准plus真菌和原生动物数据库），功能注释使用DIAMOND软件与KEGG、eggNOG和CAZy数据库比对。统计分析包括α多样性（Shannon和Simpson指数）、β多样性（PCoA和PERMANOVA）、LEfSe分析（padjust<0.01）以及Spearman相关性分析（Benjamini-Hochberg校正）。

**研究结果**

**人口学数据**
通过比较稳定组和AECOPD组患者的基线特征，研究人员发现AECOPD组患者病情更重，表现为CAT和mMRC评分更高、FEV1%预计值更低、6分钟步行距离更短；同时表现出更明显的全身炎症反应（白细胞计数、中性粒细胞百分比、CRP和D-二聚体水平升高，淋巴细胞百分比和CD4/CD8比值降低）以及更差的营养状况（白蛋白水平降低）。在AECOPD组内，FE亚组患者的CAT评分更高、CD4/CD8比值更低、PaCO₂水平更高。

**稳定组与加重组痰微生物组特征**
通过物种注释，研究人员在49份诱导痰样本中鉴定出8342种细菌、386种古菌、126种真核生物和823种病毒。在属水平，链球菌属（Streptococcus）和罗氏菌属（Rothia）在两组中均占优势，而假单胞菌属（Pseudomonas，0.1% vs 5.0%）和棒状杆菌属（Corynebacterium，1.6% vs 4.2%）在AECOPD组显著富集，嗜血杆菌属（Haemophilus，2.9% vs 1.1%）和奈瑟菌属（Neisseria，10.5% vs 1.9%）在稳定组显著富集。在种水平，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，0.03% vs 4.9%）和纹带棒状杆菌（Corynebacterium striatum，0.003% vs 3.4%）在AECOPD组富集，副流感嗜血杆菌（Haemophilus parainfluenzae，2.7% vs 0.9%）、干燥奈瑟菌（Neisseria sicca，3% vs 0.5%）和黏膜奈瑟菌（Neisseria mucosa，2.7% vs 0.4%）在稳定组富集。主坐标分析（PCoA）显示两组在属水平和种水平上群落结构均存在显著分离（属：R²=0.068，p=0.001；种：R²=0.071，p=0.001）。α多样性分析显示，稳定组的Shannon指数和Simpson指数均显著高于加重组（p<0.01），表明稳定组微生物多样性更高。

**稳定期与加重期患者代表性微生物标志物**
通过线性判别分析效应大小（LEfSe）分析，研究人员识别出两组间的差异微生物标志物。在属水平，稳定组中奈瑟菌属（Neisseria）、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）、嗜血杆菌属（Haemophilus）、孪生球菌属（Gemella）和微小单胞菌属（Parvimonas）等丰度显著增加。在种水平，干燥奈瑟菌（Neisseria sicca）、黏膜奈瑟菌（Neisseria mucosa）、副流感嗜血杆菌（Haemophilus parainfluenzae）、微小单胞菌（Parvimonas micra）和浅黄奈瑟菌（Neisseria flavescens）等在稳定组显著富集。

**稳定组与加重组痰微生物组的KEGG功能特征**
在KEGG功能注释中，代谢相关功能占比最高（13.6%），其次为遗传信息处理（4.80%）、环境信息处理（4.17%）、细胞过程（2.68%）、人类疾病（2.03%）和生物系统（0.867%）。LEfSe分析显示，环境信息处理、遗传信息处理和细胞过程在两组间差异显著，其中遗传信息处理在稳定组富集，环境信息处理和细胞过程在加重组更突出。在KEGG第三级通路中，11个通路在稳定组显著富集，包括ko00970（氨酰-tRNA生物合成）、ko03440（同源重组）、ko03070（蛋白质输出）、ko03420（核苷酸切除修复）、ko00730、ko03060、ko04112（细胞周期-柄杆菌）、ko03410（碱基切除修复）、ko00680（甲烷代谢）、ko00740和ko04930（2型糖尿病）。富集分析进一步识别出35个富集通路，其中9个与LEfSe分析重叠。KEGG模块M00053（脱氧核糖核苷酸生物合成）和M00093（磷脂酰乙醇胺生物合成）被选为稳定组的功能标志物，M00101为加重组标志物。

**稳定组与加重组痰微生物组的eggNOG功能特征**
eggNOG功能注释中，功能未知（S）占比最高（27.6%），其次为复制、重组和修复（L，9.73%）、细胞壁/膜/包膜生物合成（M，8.57%）、转录（K，6.63%）和碳水化合物转运与代谢（G，6.44%）。LEfSe分析显示，M：细胞壁/膜/包膜生物合成和W：细胞外结构在稳定组富集，T：信号转导机制在加重组更突出。在eggNOG第二级功能中，稳定组的特征标志物包括Psort定位细胞质膜（score 10.00）、转座酶活性、Hep Hag重复蛋白、多生物过程及假尿苷合酶活性，而加重组的特征标志物为碳水化合物转运。

**COPD患者痰微生物组与临床指标的相关性**
Spearman相关性分析显示，年龄、PaCO₂、中性粒细胞百分比（N%）、中性粒细胞计数（N）、D-二聚体、CRP、CAT评分和mMRC评分与多种微生物标志物（属/种水平，相对丰度>0.001）和功能标志物（KEGG第三级通路、KEGG模块和eggNOG通路）呈负相关。而体重、BMI、营养指标（总蛋白、白蛋白、前白蛋白）、淋巴细胞百分比（L%）、血红蛋白、T细胞亚群（CD3、CD4、CD4/CD8）以及肺功能指标（FEV1%预计值、FEV1/FVC和6分钟步行距离）通常与这些标志物呈正相关。

**IE组与FE组痰微生物组特征**
在IE组和FE组之间，属水平和种水平的优势微生物结构相似，主要由链球菌属（Streptococcus，26.1%）、罗氏菌属（Rothia，11.6%）和沙氏菌属（Schaalia，6.90%）组成。PCoA显示两组在属水平（R²=0.0221，p>0.05）和种水平（R²=0.0228，p>0.05）均无显著差异。α多样性分析（Shannon和Simpson指数）在两组间也无显著差异。

**IE组与FE组代表性标志物**
LEfSe分析未发现IE组和FE组之间存在显著的微生物标志物或KEGG/eggNOG功能特征差异。

**讨论与结论总结**

讨论部分指出，本研究通过深度宏基因组测序详细分析了COPD急性加重期气道微生物组的失调特征。与稳定组相比，加重期物种水平α多样性显著降低，这与既往一些研究结果一致，但部分研究（如COPDMAP和AERIS研究）报道基线期与加重期α多样性无差异，可能源于人群异质性、治疗方案或测序深度差异。在IE和FE亚组间未发现α多样性差异，提示加重发生时可能存在共同的炎症相关微生物生态紊乱模式，而后续抗菌治疗可能驱动亚组分化。功能层面，LEfSe和富集分析发现甲烷代谢通路（ko00680）在AECOPD组显著下调。甲烷作为一种有机气体分子，被认为具有调节平滑肌活性、氧化应激和炎症的潜力，甲烷富集盐水可修复肺缺血再灌注损伤并抑制炎症和凋亡。本研究首次提示气道微生物来源的甲烷可能作为局部气体信号分子，参与维持呼吸系统稳态并发挥抗炎或细胞保护作用，从而影响COPD进展。此外，稳定期微生物富集氨酰-tRNA生物合成和蛋白质输出等基础生理通路，而加重期微生物富集DNA损伤修复通路（如核苷酸切除修复和同源重组），可能反映肺部氧化应激急性增加导致的基因毒性应激。这些发现表明AECOPD不仅是微生物组成的变化，还伴随微生物群落整体生理状态从“生长模式”向“应激生存模式”的重编程。

研究结论：这项基于宏基因组学的研究揭示了AECOPD患者气道微生物组在物种多样性、群落结构和功能代谢方面的显著失调，并识别出与疾病严重程度密切相关的微生物和功能标志物。与稳定组相比，甲烷代谢通路在急性加重期下调，提示其在维持免疫稳态中可能发挥潜在作用。这些发现为COPD急性加重的微生物机制提供了新视角，并为未来基于微生物组的预测或干预策略提供了潜在生物标志物。