高分辨率熔解曲线分析(HRMA)用于铜绿假单胞菌肺部感染中D类β-内酰胺酶(CHDLs)的鉴定

《Infection and Drug Resistance》：High-Resolution Melting Curve Analysis (HRMA) for the Identification of Class D β-Lactamases (CHDLs) in Pseudomonas aeruginosa Lung Infection

　　

目的：常规实验室方法检测临床分离铜绿假单胞菌（*Pseudomonas aeruginosa*）中的碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶（CHDLs）繁琐、缓慢且灵敏度有限。本研究提出一种新型高分辨率熔解曲线分析（HRMA）方法，用于快速分子鉴定铜绿假单胞菌肺部感染中的CHDLs。方法：采用HRMA方法检测CHDLs中的*bla*_OXA基因。使用ABI Step One-Plus Manager Software版本3.2和Precision Melt Analysis Software版本3.02（Applied Biosystems）分析广泛的HRMA数据。结果：在47株产金属β-内酰胺酶（MBL）的铜绿假单胞菌菌株中，18株（38.2%）为*bla*_OXA-145阳性，24株（51.0%）为*bla*_OXA-161阳性，20株（42.5%）为*bla*_OXA-224阳性，29株（61.7%）为*bla*_OXA-539阳性，7株（14.8%）为*bla*_OXA-675阳性，19株（40.4%）为*bla*_OXA-848阳性。获得了清晰、不重叠的熔解峰（例如，*bla*_OXA-145为81.70°C，*bla*_OXA-848为87.35°C），精度为±0.1–0.5°C，可实现明确的基因型鉴定。临床上，对100株菌株进行多位点序列分型（MLST）显示，主要序列型——ST09、ST15、ST111和ST235——与多重耐药/广泛耐药（MDR/XDR）表型、生物膜形成和CHDL携带显著相关（p < 0.05）。ST235和ST09在CHDL生产者中占优势，且57%的菌株为新型或单一序列型，突显了区域遗传多样性。结论：创新之处在于仅通过独特的熔解温度（Tm）偏移和熔解曲线形态即可精确区分六种临床相关的OXA等位基因，无需使用荧光探针。在实践中，HRMA相比传统方法（如改良Hodge试验或Sanger测序）具有显著优势。作为一种闭管、单步法检测，它消除了扩增后处理，降低了交叉污染风险，并在两小时内提供可操作的结果。周转时间和试剂成本的显著降低使HRMA成为一种高度可扩展、用户友好的工具，非常适合常规临床微生物实验室，以加速铜绿假单胞菌肺部感染的抗菌药物管理和流行病学监测。

**论文解读：高分辨率熔解曲线分析用于铜绿假单胞菌肺部感染中D类β-内酰胺酶的快速鉴定**

**研究背景与目的**
呼吸道感染（RTIs）是ICU患者常见感染，铜绿假单胞菌（*Pseudomonas aeruginosa*）因其对广谱抗生素和碳青霉烯类药物的耐药性不断上升而成为重大威胁。D类β-内酰胺酶（CHDLs）通常存在于不动杆菌属，但近年来在肠杆菌科尤其是铜绿假单胞菌中也有报道，其编码的OXA酶可水解青霉素和碳青霉烯类药物。目前临床实验室检测CHDLs的方法如改良Hodge试验、Carba NP试验、基因测序等存在耗时长、灵敏度有限、操作繁琐等缺点。高分辨率熔解曲线分析（HRMA）作为一种闭管、单步法技术，可通过扩增子独特的熔解温度（Tm）和曲线形态实现基因型区分，无需探针或电泳，具有快速、低成本、低交叉污染风险等优势。然而，伊朗地区关于铜绿假单胞菌CHDLs的流行病学数据尚不充分，且此前无研究采用HRMA检测该区域的临床分离株。因此，本研究旨在：①确定肺感染铜绿假单胞菌临床分离株中MDR和XDR表型的流行率；②开发并验证一种新型HRMA方法快速检测六种临床重要的*bla*_OXA基因；③通过MLST进行CHDL阳性菌株的分子流行病学研究；④分析CHDL携带、抗生素耐药谱、生物膜形成能力与克隆性之间的关联。该论文发表在《Infection and Drug Resistance》。

**关键技术方法**
本研究为前瞻性横断面研究，样本来源于2020年2月至2021年1月伊朗哈马丹医科大学附属四家医院收治的疑似下呼吸道感染住院患者，共收集967份呼吸道标本（包括气管抽吸物、痰液、胸水、咽拭子、鼻拭子和支气管肺泡灌洗液）。通过生化试验鉴定出100株铜绿假单胞菌。主要技术方法包括：①E-test法进行抗菌药物敏感性试验，依据CLSI 2023标准判定MDR/XDR/PDR；②亚胺培南-EDTA（IED）纸片法检测金属β-内酰胺酶（MBL）表型；③改良Hodge试验（MHT）和Carba NP试验用于碳青霉烯酶表型检测；④刚果红琼脂（CRA）法评估生物膜形成能力；⑤针对*bla*_OXA-145、*bla*_OXA-161、*bla*_OXA-224、*bla*_OXA-539、*bla*_OXA-675和*bla*_OXA-848设计两对引物，采用EvaGreen染料基HRMA法在ABI StepOne Plus仪器上进行扩增和高分辨率熔解分析，通过Tm值和熔解曲线形态区分基因型；⑥MLST分析七种管家基因（*acsA*、*aroE*、*guaA*、*mutL*、*nuoD*、*ppsA*、*trpE*）的等位基因谱，确定序列型（ST）。

**研究结果**
**1. 细菌分离与鉴定**：从967份标本中分离出548株非肠杆菌科革兰阴性杆菌，经生化试验确认100株（18.2%）为铜绿假单胞菌。

**2. 抗菌药物敏感性模式**：所有菌株对粘菌素敏感（100%）。最高耐药率见于头孢西丁（92%）、环丙沙星（89%）、诺氟沙星（84%）和头孢曲松（82%）。碳青霉烯类耐药率较高：亚胺培南51%、美罗培南48%、厄他培南52%。MDR菌株占84%，XDR菌株占39%，无泛耐药（PDR）菌株。

**3. 碳青霉烯酶表型检测**：IED法显示47%菌株产MBL，MHT法阳性率49%，Carba NP试验阳性率52%。21%菌株在三种表型试验中均呈阳性，提示MBL和KPC共产生。

**4. 生物膜形成能力**：CRA法检测显示，15%菌株强产膜（黑色结晶样菌落），36%中度产膜，9%弱产膜，40%无膜形成；总体60%菌株具有生物膜形成能力。

**5. HRMA方法验证**：两对引物均能特异性扩增目标基因，无非特异性产物。引物对1（检测*bla*_OXA-145、*bla*_OXA-161、*bla*_OXA-224）检测限达1.5×10⁰ CFU/mL，引物对2（检测*bla*_OXA-539、*bla*_OXA-675、*bla*_OXA-848）检测限达1.5×10¹ CFU/mL，PCR效率99.9%–108.0%，R² > 0.98。

**6. HRMA区分*bla*_OXA基因**：所有六个目标基因产生清晰、不重叠的熔解峰，Tm分辨率±0.1–0.5°C。引物组1中，*bla*_OXA-145 Tm为81.70°C，*bla*_OXA-161为83.80°C，*bla*_OXA-224为84.90°C；引物组2中，*bla*_OXA-539 Tm为82.10°C，*bla*_OXA-675为86.60°C，*bla*_OXA-848为87.30°C。归一化差异图进一步增强了基因型区分效果。

**7. *bla*_OXA基因流行率**：在47株MBL产生菌中，*bla*_OXA-539最常见（61.7%），其次为*bla*_OXA-161（51.0%）、*bla*_OXA-224（42.5%）、*bla*_OXA-848（40.4%）、*bla*_OXA-145（38.2%）和*bla*_OXA-675（14.8%）。43%菌株同时携带两种或以上*bla*_OXA基因，最常见组合为*bla*_OXA-539 + *bla*_OXA-161（18株）。

**8. MLST分析**：100株菌株共鉴定出95个不同ST，其中ST09（12%）、ST235（10%）、ST111（9%）、ST15（8%）为最常见序列型，合计占39%。57%菌株为新型ST（此前未在PubMedST数据库中描述）。管家基因*nuoD*多态性最高（20个等位基因）。

**9. *bla*_OXA基因、耐药表型、生物膜形成与ST的关联**：携带*bla*_OXA基因的菌株对碳青霉烯类耐药率显著高于阴性菌株（亚胺培南78.3% vs 23.5%，美罗培南75.0% vs 20.6%，厄他培南80.4% vs 26.5%，p < 0.001）。携带3个及以上*bla*_OXA基因的菌株出现XDR表型的风险显著升高（OR=4.82，95% CI: 2.14–10.86，p < 0.001）。生物膜形成与*bla*_OXA基因携带显著相关（p=0.003），强产膜菌株中80.0%携带至少一个*bla*_OXA基因。主要ST（ST09、ST111、ST15、ST235）与MDR/XDR表型（p < 0.001）、生物膜产生（p=0.002）和CHDL携带（p < 0.001）显著相关。ST235菌株中90%携带*bla*_OXA基因，80%呈现XDR表型。

**讨论与结论**
本研究首次在伊朗西部对肺感染铜绿假单胞菌中CHDLs进行综合调查，并首次在中东地区应用HRMA技术检测*bla*_OXA基因。研究显示MDR（84%）和XDR（39%）表型高发，CHDLs在碳青霉烯耐药中起重要作用。所开发的HRMA方法通过熔解曲线特征成功区分六种临床重要*bla*_OXA基因，且具有高灵敏度、特异性、快速（约2小时）和低成本优势，可替代传统方法用于临床常规检测。MLST结果揭示菌株群体高度多样化（95个ST），ST235、ST09、ST111和ST15为主要高风险克隆，与MDR/XDR、生物膜形成和CHDL携带密切相关。57%的新型ST表明该区域存在显著的遗传多样性，需持续监测。研究结论为：**伊朗西部肺感染中CHDL产生且多重耐药及广泛耐药的铜绿假单胞菌菌株流行率高；最常见的*bla*_OXA基因为*bla*_OXA-539、*bla*_OXA-161和*bla*_OXA-224；开发的HRMA方法是一种快速、精确、相对廉价的工具，可检测和区分六种临床相关*bla*_OXA基因；新型序列型的高比例表明该区域铜绿假单胞菌存在显著的遗传变异。**