《Behavioural Brain Research》：Longitudinal Behavioral Profiling Reveals Early-Onset and Persistent Motor Dysfunction in a VAChT-KD Model for Congenital Myasthenic Syndrome
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囊泡乙酰胆碱转运体敲除(vesicular acetylcholine transporter knockdown, VAChT-KD)小鼠是先天性肌综合征(congenital myasthenic syndrome, CMS)的一种遗传模型，其特征是神经肌
囊泡乙酰胆碱转运体敲除(vesicular acetylcholine transporter knockdown, VAChT-KD)小鼠是先天性肌综合征(congenital myasthenic syndrome, CMS)的一种遗传模型，其特征是神经肌肉接头处的胆碱能传递受损，导致突触前神经肌肉功能障碍。研究人员在此进行了纵向行为分析，以确定运动缺陷在发育期和成年期的发生及进展，包括潜在的性别依赖效应。VAChT-KD小鼠表现出早期和持续的运动损伤。与对照组相比，新生动物表现出力量减弱、协调性受损和运动发育延迟，这些缺陷一直持续到成年期。在全局力量测试中，运动表现持续受损，而其他行为测量揭示了年龄和性别依赖的差异。值得注意的是，重复暴露于运动任务改善了突变小鼠的表现，表明存在学习成分部分补偿了潜在缺陷。在各项行为范式中，基因型和年龄成为运动表现的主要决定因素。重要的是，确定早期疾病发作和整个发育过程中可测量的功能缺陷突出了治疗干预的关键窗口。这些发现支持使用VAChT-KD小鼠作为测试早期阶段疗法的转化平台，并强调了在设计神经肌肉疾病的临床前研究时考虑行为适应的重要性。
该研究背景在于先天性肌综合征(congenital myasthenic syndrome, CMS)是一组由影响神经肌肉接头(neuromuscular junction, NMJ)传递的蛋白突变引起的遗传性神经发育疾病，临床表现包括肌无力、易疲劳及运动发育迟缓，常于婴幼儿期起病且易被误诊，因此亟需合适的动物模型以理解疾病进展并识别治疗策略。现有多数CMS相关动物模型出生后短期存活，限制了纵向行为研究，而VAChT-KD小鼠作为突触前CMS模型，VAChT蛋白表达约降低70%导致胆碱能神经传递受损且寿命较长，但既往研究多聚焦约3月龄雄性成体，发育期运动障碍的发生与进展尚不清楚。明确VAChT-KD小鼠行为异常首发时间有助于识别关键治疗窗口并提升模型转化价值，故研究人员对新生、幼年及成年VAChT-KD与野生型(wild type, WT)雌雄小鼠开展纵向运动行为表征，通过系列运动测试评估全生命周期的力量、协调性、运动发育及运动学习以界定该模型中肌无力表型的发生与进展。
研究人员所用主要关键技术方法包括：使用来自同源重组构建的VAChT-KD小鼠及其WT同窝仔鼠作为样本队列，新生组为7只VAChT-KD与9只WT，断奶后按性别分为WT雄性、VAChT-KD雄性、WT雌性、VAChT-KD雌性每组各7只；新生儿期在出生后(postnatal day, P)3、5、8、10、12进行适合新生鼠的运动电池测试包括移动(ambulation)、后肢足角度(hindlimb foot angle)、表面翻正(surface righting)、负向地性(negative geotaxis)、后肢悬吊(hindlimb suspension)、抓握力(grip strength)、抓握反射(grasping reflex)、悬崖回避(cliff aversion)；幼年和成年期在P30、P60–P120进行钢丝悬挂(wire hang)、抓握力(grip force)、转棒(rotarod)测试；计算转棒测试的运动学习指数(motor learning index, MLI)；统计分析采用双因素方差分析(two-way ANOVA)、比例优势逻辑回归(polr)、贝叶斯混合效应多项模型、主成分分析(principal component analysis, PCA)、冗余分析(redundancy analysis, RDA)等。
研究结果如下：
3.1. VAChT-KD mice exhibit selective motor impairments during early postnatal development (P3-P12)
通过分析新生儿期体重无基因型差异排除体重干扰后，研究人员发现后肢足角度受年龄与基因型显著影响，VAChT-KD小鼠角度更大提示后肢姿势成熟改变与运动发育受损；悬崖回避同样受年龄与基因型影响，VAChT-KD潜伏期更长提示力量、协调性或前庭功能缺陷；而表面翻正仅受年龄影响无基因型差异，后肢悬吊与抓握力随年龄改善但无基因型效应，负向地性无年龄、基因型及交互作用，表明VAChT-KD新生鼠在早期需协调 locomotion与姿势控制的任务中存在选择性运动损伤。
3.2. VAChT-KD mice exhibit delayed acquisition and altered refinement of motor behaviors during postnatal development (P3–P12)
定性分析显示移动表现有显著年龄效应与基因型×年龄交互作用，P10与P12时VAChT-KD显著差于WT，提示协调行走获得延迟；负向地性有早期基因型效应与交互作用，P12时VAChT-KD更常左转或未完成转向而WT多右转，提示运动策略细化改变；表面翻正、后肢悬吊与抓握反射无基因型差异，表明减少的胆碱能功能主要在从爬行到协调行走过渡期破坏运动发育轨迹。
3.3. VAChT-KD mice exhibit distinct developmental trajectories of motor behavior during postnatal development (P3–P12)
主成分分析(PCA)显示基因型与出生后年龄均显著贡献数据分布，前两主成分解释约50%总方差，VAChT-KD与WT置信椭圆不重叠提示行为表现一致偏移；冗余分析(RDA)确认出生后年龄为主要因素塑造行为变异，基因型次之，年龄沿RDA1轴、基因型沿RDA2轴分离，表明发育阶段与基因型共同塑造产后运动行为全局组织，基因型显著调节VAChT-KD轨迹。
3.4. Young and adult VAChT-KD mice (P30–P120) exhibit persistent motor impairments
体重无整体基因型效应但有性别内差异且不影响行为表现。钢丝悬挂测试VAChT-KD显著差于WT且各时间点两性均显著，提示力量与耐力持续缺陷；前肢抓握力有基因型与年龄效应，雄性在P90–P120降低，雌性无稳健差异，全肢抓握力同样基因型与年龄显著但无交互，雄性P120差异、雌性无；转棒测试基因型显著缩短跌落潜伏期，雄性P90、雌性P30/P60/P90差异，表明青年至成年VAChT-KD在力量、耐力、协调与整体运动表现存在持续损伤。
3.5. Minimal sex differences in motor performance in young and adult mice (P30–P120)
钢丝悬挂无性别差异；抓握力中WT雄性P120强于雌性对应体重差异，VAChT-KD雄性P60前肢强于雌性但后期不维持且全肢无；转棒中WT两性相似，VAChT-KD雄性P30优于雌性为短暂性别依赖差异；总体性别对运动表现影响有限，仅特定测量有轻微年龄依赖差异。
3.6. VAChT-KD mice retain motor learning capacity despite persistent motor deficits
转棒在P120无基因型差异推测因重复暴露促进学习补偿，计算运动学习指数(MLI)显示VAChT-KD两性均为正值提示表现渐进改善，仅雌性P30–P60基因型差异；使用P120转棒幼稚队列测试时VAChT-KD显著差于WT，证实突变鼠保留运动学习能力，重复暴露可部分掩盖潜在缺陷。
3.7. Multivariate analyses identify genotype as the primary determinant of behavioral variability in young and adult mice (P30-P120)
PCA前两主成分解释约74%总方差，基因型为主要分布因子分离WT与VAChT-KD且椭圆重叠少；RDA确认基因型为主要贡献者，性别沿RDA2轴贡献较小，表明青年与成年鼠中基因型是行为结果主导因素，性别影响相对有限。
讨论部分总结：研究人员证明VAChT-KD小鼠存在从新生到成年的早发持续运动损伤，尤其在需协调locomotion、姿势控制、力量与耐力的任务中，产后发育期定量显示协调行走获得延迟与成熟运动行为细化改变，多变量分析确认基因型为主要行为变异决定因素、年龄解释运动成熟进程，尽管有损伤VAChT-KD保留运动学习能力，行为适应可部分缓解功能缺陷，凸显胆碱能信号在运动发育中的作用及突触功能障碍与行为可塑性共存。VAChT-KD存活至成年允许纵向评估，人类VAChT致病变异定义突触前CMS早发易疲劳肌无力，本研究识别早期缺陷为检测生物标志物与发育期干预提供框架。新生儿期选择在爬行到协调行走过渡期出现协调、成熟与姿势控制选择性损伤但均随发育进步提示胆碱能降低延迟而非阻止成熟。青年成年持续损伤巩固模型效度，转棒后期部分正常化源于学习而非功能恢复。性别差异轻微不一致多与生理大小有关而非疾病特异，符合临床CMS无一致性别差异报道。局限包括未直接评估NMJ生理、纵向学习混淆、未测VAChT表达/NMJ形态/ACh水平/mEPPs等及新生儿未定性别未来用DNA鉴定，模型未涵盖人类全部异质性。综上VAChT-KD再现全生命周期早发持续运动障碍，是CMS纵向研究有价值平台，早期可测缺陷突出治疗窗口，强调发育阶段与行为适应在神经肌肉疾病临床前评估的重要性。
研究结论部分翻译：在本研究中，研究人员证明VAChT-KD小鼠表现出从新生阶段延续至成年的早发性且持续的运动功能障碍。缺陷在需要协调运动、姿势控制、肌肉力量和耐力的任务中尤为明显。定量分析进一步揭示出生后发育期间协调运动行为的获得延迟及成熟细化改变。多变量分析通过确定基因型为行为变异的主要决定因素支持了这些发现，而年龄主要解释了运动成熟的预期进展。值得注意的是，尽管存在这些损伤，VAChT-KD小鼠保留了运动学习能力，表明代偿性行为适应可随时间部分减轻功能缺陷。总之，这些结果强调了胆碱能信号传导在运动发育中的关键作用，并证明持续的突触功能障碍可与实质性的行可塑性共存。自最初表征以来，VAChT-KD小鼠系已成为突触前CMS的稳健且广泛使用的模型。囊泡乙酰胆碱转运体表达减少限制了乙酰胆碱加载入突触小泡，从而降低神经肌肉接头处的量子乙酰胆碱释放，损害神经肌肉信号传导和运动功能。重要的是，与更严重如VAChT敲除小鼠出生后不久死于呼吸衰竭的胆碱能模型不同，VAChT-KD小鼠存活至成年，使得能够纵向评估疾病进展和行为适应。CMS包含由影响神经肌肉接头多个组分特别是胆碱能突触内蛋白的突变引起的一组异质性疾病。值得注意的是，人类中已鉴定出VAChT的致病变异，定义了因乙酰胆碱释放受损导致的早发性、易疲劳肌无力为特征的突触前型CMS。在此背景下，确定VAChT-KD小鼠运动异常的发育 onset尤为重要。本研究发现早期缺陷为检测早期功能生物标志物和在运动回路仍处于成熟且可能对治疗调节有反应的发育阶段评估干预提供了框架。新生儿行为分析揭示VAChT-KD小鼠在运动协调、运动成熟和姿势控制方面存在选择性损伤。这些异常出现在从爬行到协调行走的过渡期，该发育期以支持成熟运动行为出现的神经肌肉和感觉运动回路快速成熟为特征。尽管突变小鼠始终差于WT同窝仔，两组均随出生后发育表现渐进改善，表明胆碱能传递减少延迟但未阻止运动成熟。多变量分析进一步支持新生儿VAChT-KD小鼠存在改变的发育轨迹。PCA和RDA确定基因型和年龄均为行为组织的主要贡献者，基因型导致整体表现谱明显偏移。这些发现尤其相关因为CMS症状常早发，支持VAChT-KD小鼠在调查早期疾病进展和发育易损性方面的转化价值。青年和成年小鼠行为评估证明VAChT-KD动物在力量、耐力、协调和运动表现方面持续损伤，强化其作为肌无力功能障碍模型的有效性。各年龄和性别钢丝悬挂表现降低表明全局神经肌肉功能稳定缺陷。相反，抓握力缺陷在较晚年龄更明显尤其在成年雄性，提示可能与身体成分和运动成熟差异相关的轻微性别依赖效应。然而多变量分析一致确定基因型为影响行为变异的主导因素，而性别对整体表现贡献相对较小。有趣的是尽管其他运动任务持续缺陷，转棒表现在后期部分正常化。使用转棒幼稚P120小鼠的额外实验证明这种 apparent“恢复”主要归因于重复任务暴露诱导的运动学习而非神经肌肉功能恢复。这些发现表明尽管慢性胆碱能功能障碍，VAChT-KD小鼠保留实质运动学习能力。更广泛地说，它们强调了纵向行为研究的重要考虑：重复测试可通过行为适应和经验依赖补偿部分掩盖潜在缺陷，与先前使用重复转棒范式报道一致。性别差异轻微且在行为测定中不一致。雄性在孤立时间点偶尔优于雌性，可能反映力量和体型生理差异而非疾病特异效应。此观察与临床CMS文献一致，其中未一致报告稳健性别差异。这些发现表明基因型和发育阶段是VAChT-KD小鼠运动功能障碍的主要决定因素。但仍应承认一些局限。尽管行为电池捕获运动功能多个域，但未直接评估神经肌肉接头生理，而后者是建立突触功能障碍与行为结果间机制联系所必需的。此外，纵向测试引入与运动学习和任务熟悉相关的潜在混淆，尤其在转棒等测定中，且此处未考虑与随时间运动表现及其改变相关的细胞机制如VAChT表达、NMJ形态、ACh水平、mEPPs等。相关机制更可能与中枢突触可塑性相关，即使在转运体表达降低背景下似乎在VAChT-KD小鼠中保存良好。此外承认因新生儿期难以表型识别性别而未鉴定是另一局限，作为重要特征未来研究将通过DNA鉴定新生儿小鼠此参数。最后虽然VAChT-KD小鼠重现突触前CMS重要特征，但未涵盖人类患者观察到的全部遗传和临床异质性。综上这些发现证明VAChT-KD小鼠在发育期和成年期重现早发持续运动功能障碍，确立该模型作为先天性肌综合征纵向研究的有价值平台。早期出生后发育期间可测量缺陷的识别突出了治疗干预的潜在重要窗口，此时神经肌肉功能障碍可能仍部分可接受补偿。更广泛地说，本研究强调在评估纵向临床前模型中的神经肌肉功能障碍和治疗效力时考虑发育阶段和行为适应的重要性。
