生物活性3D打印瓣膜支架通过免疫调节与内皮化促进瓣膜再生

《Bioactive Materials》：Bioactive 3D-Printed valve scaffold promoting valvular regeneration via immunomodulation and endothelialization

　　

组织工程心脏瓣膜（Tissue-engineered heart valves, TEHVs）的在体性能仍受限于血液?材料界面持续存在的早期失败三联征，即血栓形成、未解决的炎症及缓慢的内皮化。在此，研究人员设计了一种生物指导性多层瓣膜支架，通过空间整合的结构与生物学功能来解决这些界面屏障。该支架由数字可编程3D打印框架、丝素蛋白（Silk fibroin, SF）包裹层以及掺入Arg?Gly?Asp（RGD）/明胶甲基丙烯酰（Gelatin methacryloyl, GelMA）黏附信号与H2S释放微凝胶的水凝胶生物界面组成。这种分层设计赋予构建体瓣膜相关的拉伸性能，同时编程免疫?内皮微环境。水凝胶生物界面促进内皮细胞迁移、增殖和血管生成活性，而持续性H2S递送使巨噬细胞偏向促消退的M2样表型并抑制炎症活化。转录组分析进一步揭示与内皮修复、迁移和增殖相关的内皮程序协调上调，伴随应激和炎症相关反应的减弱。在体实验中，该支架减轻血栓炎症反应，显示出初步的抗钙化性能，并在血液接触条件下支持内皮化。总之，本研究建立了一种分层生物活性工程策略，将被动的3D打印结构支架转化为具有再生能力、血液相容性和免疫调节功能的生物功能性瓣膜支架。该策略为进一步开发再生性瓣膜支架提供了颇具前景的设计原则。

该研究发表于《Bioactive Materials》。目前瓣膜性心脏病仍是全球重大健康负担，现有机械瓣需终身抗凝且无生长潜力，生物瓣易钙化退化且内皮化有限，尤其在儿科患者中缺乏终极解决方案。组织工程心脏瓣膜（TEHV）虽具前景，但早期面临血栓、炎症与内皮化延迟的三联征，单一参数优化不足。为此，研究人员提出一种空间组织的PM/SF/水凝胶支架架构，整合多孔结构稳定性、界面生物相容性、免疫调节与内皮引导功能，通过数字光处理（Digital light processing, DLP）打印聚己内酯三醇甲基丙烯酸酯（Polycaprolactone triol methacrylate, PM）框架，包裹丝素蛋白（SF），表层构建含H₂S释放过氧硫代氨基甲酸酯（Peroxythiocarbamate, PTC）?GelMA微凝胶（PGM）及8臂聚乙二醇二丙烯酸酯（8-arm polyethylene glycol diacrylate, 8-arm PEGDA）/GelMA/RGDAA的水凝胶（PGR），实现力学支撑与微环境协同调控，在体内外证实其改善血液相容性、诱导M2巨噬极化、抗钙化及促进内皮化的作用。

作者主要采用的关键技术方法包括：利用数字光处理（DLP）3D打印技术制备PM多孔瓣膜支架；通过微流控技术制备PTC?GelMA微凝胶（PGM）；采用聚多巴胺（Polydopamine, PDMA）介导的界面耦合将PGR水凝胶层固定于SF/PM复合支架表面；进行体外细胞实验（人脐静脉内皮细胞HUVECs、RAW264.7巨噬细胞）评估细胞相容性、迁移、管形成及极化；利用RNA测序（RNA sequencing, RNA?seq）分析巨噬细胞与内皮细胞转录组；通过大鼠皮下植入、新西兰大白兔动静脉分流及颈动脉植入模型评估体内组织相容性、免疫调节、抗血栓与内皮化性能。

2.1. Development and characterization of PM resin and SF/PM scaffold

研究人员合成了光固化单体聚己内酯三醇甲基丙烯酸酯（PM）并配制树脂，表征其粘度与光聚合动力学，证实DLP打印具有高精度与结构保真度；通过溶液蒸发法在PM骨架上包覆丝素蛋白（SF）膜，FT?IR与拉曼光谱证实SF以β?折叠主导的二级结构，拉伸测试显示SF/PM支架极限抗拉强度约16.24 MPa、弹性模量约89.02 MPa，优于天然心脏瓣膜，PBS中3个月降解显示SF与PM分别失重19.73%与3.28%。

2.2. Preparation and characterization of bioactive PGM@PGR/SF/PM scaffold

研究人员合成ROS响应性H₂S供体过氧硫代氨基甲酸酯（PTC），通过微流控制备平均直径约58.63 μm的PGM；利用PDMA界面层将PGR水凝胶（含8?arm PEGDA、GelMA、RGDAA）共价耦合于SF/PM，交联截面厚约7 μm，粘附强度约31.8 kPa；水接触角从PM的115.62°降至PGR/SF/PM的63.43°；体外钙化实验显示PGR/SF/PM与PGM@PGR/SF/PM钙含量约2.8 μg mg^?1，显著低于戊二醛交联瓣膜（GV）的7.77 μg mg^?1；HPLC证实PGM在H₂O₂触发下可持续释放H₂S（以对羟基苯甲醇p?HBA生成间接表征），脉冲流测试显示涂层在循环载荷下短期结构稳定。

2.3. Cytocompatibility evaluation of scaffold materials

研究人员通过CCK?8与活死染色评估，H₂S供体浓度≤100 μM对HUVECs与RAW264.7无显著毒性；PGR/SF/PM与PGM@PGR/SF/PM组HUVEC密度与增殖趋势与对照相当，PGM@PGR/SF/PM在第5天OD450显著升高，提示GelMA/RGDAA黏附信号与H₂S协同支持内皮细胞存活增殖。

2.4. Immunomodulatory functionality of bioactive scaffolds

研究人员在氧化应激下共培养RAW264.7，荧光染色与ELISA显示PGM@PGR/SF/PM组M1标志物CD86、TNF?α下调，M2标志物CD206、IL?10上调，形态呈伸长状；H₂S探针AzMC证实PTC在H₂O₂存在下剂量依赖性释放H₂S；表明PGM@PGR通过ROS触发H₂S释放促进巨噬细胞向促消退M2样表型极化。

2.5. Scaffold-driven gene expression in macrophages

研究人员对共培养巨噬细胞行RNA?seq，PGM@PGR/SF/PM vs PGR/SF/PM有71上调、72下调基因，GO与GSEA富集于巨噬细胞迁移、炎症响应、ROS代谢过程；Western blot显示PGM@PGR/SF/PM组p?AKT/AKT与p?mTOR/mTOR分别约为对照的11倍与6倍；Hbegf、Gdf15等修复相关基因上调，表明H₂S重塑巨噬细胞转录谱，激活AKT/mTOR信号促进免疫调节与组织修复表型。

2.6. Endothelial cell behavior mediated by bioactive scaffolds

研究人员以HUVECs为模型，划痕与Transwell实验显示PGM@PGR/SF/PM显著增强细胞迁移，48 h伤口闭合面积最大；管形成实验显示其形成最广泛血管样网络，网孔数显著增多；RT?qPCR显示CD31、VEGF表达上调；表明复合生物界面通过黏附信号与H₂S协同促进内皮细胞迁移、成管与功能表型。

2.7. Scaffold-driven gene expression in endothelial cells

研究人员对HUVECs行RNA?seq，PGM@PGR/SF/PM引起最广泛转录重编程，上调Nr4a3、Hspg2等，下调Ptpdr、Prdm16；GO与GSEA富集细胞迁移、增殖、核受体活性、血管平滑肌正向调节等；Reactome分析揭示H₂S通过GAB1?PI3K/AKT轴与YAP1/TAZ刺激基因表达及G1/S转换、有丝分裂执行等细胞周期程序促进内皮化；巨噬细胞中Hbegf上调与内皮EGFR?GAB1?PI3K/AKT富集一致，支持免疫?内皮旁分泌修复轴。

2.8. Tissue compatibility of scaffold materials

研究人员行SD大鼠皮下植入4周，H&E显示各组无坏死脓肿，PGM@PGR/SF/PM炎症最轻；免疫荧光显示其M1（CD86、iNOS）最少、M2（CD206、Arg?1）最多；茜素红染色与ICP显示钙含量SF/PM为2.2±0.4 μg mg^?1，PGR/SF/PM为1.7±0.3 μg mg^?1，PGM@PGR/SF/PM为1.3±0.1 μg mg^?1；表明功能化支架体内组织相容性良好，具免疫调节与抗钙化潜力。

2.9. Performance evaluation of the scaffold under hemodynamic conditions

研究人员溶血实验各支架溶血率均<5%（SF/PM 0.93%、PGR/SF/PM 0.39%、PGM@PGR/SF/PM 0.35%）；体外血栓与兔动静脉分流显示PGR涂层显著减少血栓与血小板黏附，SEM见表面洁净；新西兰大白兔颈动脉植入4周多普勒示血流通畅，免疫荧光显示PGM@PGR/SF/PM M2主导、CD31内皮覆盖与波形蛋白（Vimentin）阳性细胞浸润最多；3个月von Kossa染色示其几乎无钙化，主要脏器H&E无异常，证实血流环境下血液相容性与内皮化支持能力。

总结讨论部分，组织工程心脏瓣膜支架不应仅作为被动结构替代物，而可整合生物活性界面信号。本研究通过数字可编程支架与分层H₂S释放生物界面结合，表明瓣膜支架植入后早期响应可通过血液相容性、炎症与内皮化的协同调节来引导。多层PGM@PGR/SF/PM构建体提供可比拟瓣膜的拉伸性能，同时建立促再生免疫?内皮生态位，抑制血栓炎症、展现抗钙化潜力并支持内皮化。重要的是，数据表明成功的再生瓣膜设计不应仅视为力学或架构挑战，而是跨越结构、免疫与血管维度的界面编程问题。因此，本研究为未来再生心脏瓣膜工程提供了一种颇具前景的支架与可推广的设计原则。

翻译研究结论部分：而非仅作为被动结构替代物，组织工程心脏瓣膜支架可能受益于生物活性界面信号的整合。通过将数字可编程支架与分层H₂S释放生物界面相结合，研究人员的研究提示瓣膜支架植入后的早期响应可通过血液相容性、炎症与内皮化的协同调节来引导。多层PGM@PGR/SF/PM构建体提供与报道的瓣膜相当的拉伸性能，同时建立抑制血栓炎症反应、展现抗钙化潜力并支持内皮化的促再生免疫?内皮生态位。重要的是，这些发现表明成功的再生瓣膜设计不应仅视为力学或架构挑战，而应视为跨越结构、免疫与血管维度的界面编程问题。因此，本研究为未来再生心脏瓣膜工程提供了一种颇具前景的支架与通用设计原则。