《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Direct Current Electric Field Induces Non-linear NPFFR2 Accumulation and Alters Its Predicted Conformational Stability in Murine Thioglycolate-elicited peritoneal macrophages
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摘要神经肽FF受体2（NPFFR2）与骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）的生物电反应有关。然而，由于巨噬细胞群体的功能多样性，组织巨噬细胞的特异性反应尚未被充分研究。在本研究中，我们通过结合细胞实验、转录组学和分子动力学模拟，研究了直流电场刺激对原始硫代乙醇酸诱导的腹膜巨噬细胞（T
摘要
神经肽FF受体2（NPFFR2）与骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）的生物电反应有关。然而，由于巨噬细胞群体的功能多样性，组织巨噬细胞的特异性反应尚未被充分研究。在本研究中，我们通过结合细胞实验、转录组学和分子动力学模拟，研究了直流电场刺激对原始硫代乙醇酸诱导的腹膜巨噬细胞（TEPMs）中NPFFR2的调控作用。我们的数据表明，25—200 mV/mm的直流电场强度可引发TEPMs的形态极化，同时保持其代谢活性。与通常在招募来的BMDMs中观察到的受体下调不同，直流电场暴露——尤其是25和150 mV/mm的强度——会导致野生型TEPMs中NPFFR2蛋白水平上升。分子动力学模拟表明，高强度电场可能会使NPFFR2的核心结构不稳定，从而促使其构象展开。不过，细胞实验却显示该蛋白有净积累现象。转录组学和生化分析表明，这种积累可能是由于一种补偿性的生物合成反应，用以抵消结构不稳定带来的降解压力。综合这些观察结果，可以认为直流电场对NPFFR2的调控具有细胞类型特异性。我们提出了一种模型，即巨噬细胞中的蛋白积累是通过激活生物能量和翻译途径来维持的，以此来抵消电场带来的物理脆弱性。
引言
内源性的直流电场在组织微环境中起着生理信号的作用，尤其是在损伤和炎症期间[2]。作为免疫系统的哨兵，巨噬细胞能够感知这些电信号，通过趋电性来协调组织修复和炎症反应[1]。
不过，巨噬细胞在功能和发育上存在多样性。来自骨髓的“招募”巨噬细胞（如骨髓来源的巨噬细胞BMDMs）与在组织中固有的巨噬细胞群体（如TEPMs）之间存在本质区别[6]。鉴于它们不同的分化路径和微环境，这些亚群对相同物理刺激的反应可能有所不同。这种多样性为研究生物电效应增加了复杂性。在此背景下，检测特定膜受体的表达动态或许能为了解巨噬细胞如何适应直流电场刺激提供分子层面的视角。
神经肽FF系统由内源性RF酰胺肽及其主要的G蛋白偶联受体NPFFR1和NPFFR2组成，是一个重要的调控网络。虽然它在中枢神经系统中的传统功能，如调节痛觉、阿片类药物耐受性和能量平衡，已有较多研究报道7, 8，但最新证据表明它还参与免疫调节9, 10, 11。NPFFR2在巨噬细胞和小胶质细胞中表达，参与炎症调节。正是NPFFR2信号传导与免疫功能的交叉点，促使我们探索其在生物电环境中的行为。
在之前的研究中[12]，我们发现直流电场暴露会导致BMDMs中NPFFR2蛋白水平显著下降[13]，这表明直流电场-NPFFR2轴与巨噬细胞的机械生物学特性有关。然而，在生理状态下，组织巨噬细胞通常是首先对局部电信号作出反应的细胞。考虑到招募来的巨噬细胞与组织固有巨噬细胞在发育和代谢上的差异，我们推测TEPMs可能会以不同的方式处理这些物理信号。因此，本研究不仅是对之前在骨髓来源巨噬细胞中观察结果的延伸，更在生物学范式和机制深度上做出了新的贡献。首先，在生物学层面，我们揭示了在感知物理信号时存在的“谱系差异适应性”现象：与在电物理应力作用下采取受体脱敏（下调）策略的招募来的BMDMs不同，天然的TEPMs通过异常的补偿性受体上调表现出极为强的代谢韧性。这凸显了细胞谱系和微环境对生物电反应模式的深远影响。其次，在机制探索的深度方面，本研究通过结合先进的分子动力学模拟（用于评估受体在物理应力下的内在结构稳定性）与多维度的分子生物学验证（用于揭示转录组和翻译层面的生物能量补偿网络），超越了单纯的宏观表型描述。通过这一跨学科框架，本研究旨在建立一套完整的“结构不稳定-生物能量补偿”理论模型，从而为理解天然免疫网络如何感知并适应物理微环境变化提供新的机制视角。
在蛋白质水平上评估反应时，我们发现了一种独特的调控模式：直流电场暴露会导致TEPMs中NPFFR2蛋白的非线性上调，尤其是在低强度（25 mV/mm）和中等强度（150 mV/mm）的电场下。这与之前在BMDMs中观察到的均匀抑制现象不同。随后的转录组分析（RNA-seq）显示，Npffr2 mRNA水平保持稳定，这表明该现象可能是由转录后机制引起的。近年来，包括分子动力学模拟、结合自由能计算以及基于机器学习的预测模型在内的一系列计算机模拟方法，已成为解析复杂生物分子动态和相互作用的重要工具，它们与实验研究相辅相成，有助于从原子尺度上了解蛋白质如何响应其物理/化学微环境14, 15, 16, 17, 18。为了进一步探究电场与受体之间的生物物理相互作用，我们进行了分子动力学模拟。这些模拟利用了基于最近高分辨率人类冷冻电镜结构（如PDB: 9M10, 9JFY）19, 20构建的小鼠NPFFR2核心结构同源模型，为评估蛋白质在电场作用下的内在构象稳定性提供了平台。通过整合细胞观察结果、转录组数据以及分子模拟结果，本研究旨在阐明直流电场在巨噬细胞中对NPFFR2的转录后调控机制，从而为理解细胞状态如何影响物理信号的解读提供更广阔的视角。
章节节选
伦理声明
所有动物实验均严格遵循《赫尔辛基宣言》中规定的伦理原则进行。研究方案已得到西北工业大学伦理委员会的审核批准（方案编号：202201042）。在实验过程中，我们采取了适当措施，尽量减少动物的不适和痛苦。
实验动物
实验用的雄性C57BL/6J野生型小鼠体重在18–22克之间，来自西安交通大学。Npffr2基因敲除小鼠（Npffr2-/-）也被用于实验。
直流电场通过激活代谢而非产生细胞毒性来调控TEPMs
在研究直流电场对TEPMs的生物学影响之前，首先需要确定该物理刺激的生理耐受阈值。与毒理学研究中常见的细胞死亡表型不同，CCK-8检测显示出了独特的代谢反应模式。在50到150 mV/mm的生理相关电场强度下，野生型和< />-/-型TEPMs的线粒体代谢活性并未受到抑制，反而有所增加
分子动力学模拟的温度设定
在分子动力学模拟中，温度是一个关键参数，它决定了蛋白质的热力学性质和构象采样情况。在本研究中，模拟温度设定为300 K（约27°C），而哺乳动物的生理体温则为310 K（37°C）。选择这个温度是基于力场精度和数据可比性方面的方法学考虑。
首先，300 K是标准的参考温度
不同的电反应：驻留巨噬细胞与招募巨噬细胞
本研究的一个重要发现是，在相同的直流电场刺激下，TEPMs与BMDMs的NPFFR2调控模式存在明显差异。BMDMs的受体表达出现显著抑制，而TEPMs则出现补偿性上调。这种“相同谱系，不同命运”的现象体现了细胞在应对物理微环境压力时的巨大差异。作为快速动员的效应细胞群体，招募来的BMDMs可能会采用某种策略
结论
本研究通过结合细胞实验、转录组测序和分子动力学模拟，阐明了直流电场对TEPMs中神经肽FF受体2的调控机制。主要研究发现如下：
首先，直流电场对TEPMs中NPFFR2蛋白的表达具有非线性的正向调控作用。与之前在BMDMs中观察到的受体抑制现象不同，25和150 mV/mm的直流电场强度
CRediT作者贡献说明
Ziyi Zuo： 数据整理。Yunfei Chen： 数据整理。Xinyue Xu： 数据整理。Johansson Nellie Alicia： 数据整理。Yulong Sun： 文章撰写——审阅与编辑，资金获取。Yanwei Fang： 资源准备，实验开展。Mengya Zhao： 文章撰写——初稿撰写，资源准备，正式分析，数据整理，概念构思
资助情况
本研究得到了中国国家自然科学基金（编号81741128和编号81401553）、西北工业大学的国家级创新创业计划，以及NPU生命科学与技术学院本科生国际学生创新计划的资助（编号W007101）。
致谢
作者们感谢西北工业大学生命科学与技术学院中央实验室的王哲技师、杨周琪技师、苏继军技师、张伟举技师、党凯技师以及王军技师的鼎力支持。同时，作者们也衷心感谢两位审稿人提出的富有洞察力且专业的意见，这些意见极大地提升了论文的质量。
Mengya Zhao|Yanwei Fang|Yunfei Chen|Ziyi Zuo|Nellie Alicia Johansson|Xinyue Xu|Yulong Sun
陕西省西安市710072，西北工业大学，生命科学与技术学院，空间生物科学与生物技术重点实验室，特殊环境生物物理学研究所，特殊环境生物力学与医学工程研究中心，教育部生物诊断、治疗与防护技术装备工程研究中心
