环区脯氨酸残基对Fab结构稳定性及聚集行为的位点依赖性影响

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Position-dependent effects of loop proline residues on Fab stability and aggregation

　　

摘要

脯氨酸残基在蛋白质的结构稳定性中起着重要作用，因为其环状侧链会对肽主链施加强烈的构象约束。然而，脯氨酸残基对抗体片段的稳定性及理化性质的贡献目前尚不明确。在本研究中，我们探讨了阿达利姆单抗抗原结合片段（Fab）H链环区中脯氨酸残基的结构作用。为评估天然脯氨酸残基的贡献，我们将三个环区脯氨酸（Pro14、Pro41和Pro210）分别替换为甘氨酸。圆二色光谱分析和抗原结合实验表明，这些替换并未显著影响Fab的二级结构或抗原结合活性。相反，差示扫描量热法显示，这些替换对热稳定性存在位置依赖性影响：H:P41G的熔点明显下降，而H:P14G则出现双相热转变，这表明可变区与恒定区的协同展开被破坏。

基于人类抗体同种型间的序列保守性，我们设计了恒定区中的八个含脯氨酸的变异体。其中，H:K209P不仅具有部分稳定作用，其热转变温度也高于野生型Fab。值得注意的是，K209P替换还降低了pH值变化条件下的聚集现象。这些研究结果表明，环区脯氨酸残基有助于提升Fab的稳定性以及各结构域间的协同作用，强调了在抗体工程中引入脯氨酸残基时需考虑周围结构特征的重要性。

引言

自20世纪90年代以来，基于抗体的治疗手段发展迅速，已有超过100种抗体类药物获批用于治疗多种疾病，包括癌症、传染病、自身免疫性疾病以及慢性炎症性疾病[1]。尽管人们开发出了多种工程化抗体形式，如抗体片段、双特异性抗体以及抗体融合蛋白，以拓展其治疗应用范围，但目前获批的大多数抗体疗法仍以全长免疫球蛋白G（IgG）分子为基础[2]。全长IgG的生产通常依赖于中国仓鼠卵巢细胞等哺乳动物表达系统，这类系统需要复杂的生产平台，且制造成本高昂。相比之下，抗原结合抗体片段（Fabs）可通过大肠杆菌和酵母等微生物宿主进行生产[3]、[4]，从而便于通过基因操作实现高效生产和抗体工程改造[5]、[6]。此外，由于分子体积较小，Fabs具有良好的组织渗透性且能快速从体内清除；缺乏Fc区域可减少非特异性免疫激活[7]、[8]、[9]，同时其热稳定性也高于单链可变片段[10]。而全长IgG抗体则凭借Fc区域的优势，具有更长的血清半衰期以及由Fc介导的效应功能。因此，Fabs被视为治疗和诊断应用中可靠的替代方案[11]、[12]、[13]。

在抗体片段的制造、配方设计、储存、运输和给药过程中，它们会面临各种理化应力，从而导致抗体分子结构不稳定并发生聚集[14]。这种不稳定性是抗体疗法面临的主要挑战，因为聚集或变性的抗体在给药后可能引发免疫反应，进而降低治疗效果[15]、[16]、[17]。因此，提高抗体分子的结构稳定性对于抑制生产和处理过程中的变性和聚集至关重要；不过，目前尚未形成通用的抗体稳定化设计原则。

为在保持生物功能的同时提升蛋白质稳定性，人们开发出了多种蛋白质工程策略，包括定向进化和理性设计。定向进化依赖于随机突变和筛选的迭代循环，已被成功用于提高抗体的亲和力与稳定性；但这一方法需要大量的实验工作和繁琐的筛选过程[18]。而理性设计策略则通常以结构和序列数据为依据。例如，共识设计会选用在同源蛋白质序列比对中最常见的氨基酸残基，而互补决定区移植技术则是将互补决定区转移到稳定的抗体框架上。Ewert等人[19]、[20]证明，优化疏水核心的堆积结构以及稳定电荷簇是提升人类重链可变区（V_H）稳定性的有效方法。针对单链可变片段和Fab等抗体片段，人们也探索了其他稳定化策略。比如，在V_H与轻链可变区（V_L）的交界处引入非天然二硫键，可增强各结构域间的相互作用，进而提高结构稳定性[21]。

近年来，计算方法也被应用于抗体工程领域。分子动力学模拟可用于识别抗体分子中结构灵活性较高的区域，通过对这些区域进行针对性替换以提高其局部刚性，进而提升热稳定性[22]。在氨基酸序列中引入脯氨酸残基是一种有效的理性设计策略，可用于提高蛋白质的热稳定性[23]。脯氨酸因其含有参与构成主链氮的环状侧链结构，能够独特地限制主链二面角。这种构象约束会降低未折叠状态的熵值，增大未折叠态与天然态之间的自由能差异，从而稳定蛋白质结构[24]。

在之前使用于酵母菌中表达的阿达利姆单抗衍生Fab的研究中，我们试图确定那些有助于提升Fab热稳定性的氨基酸残基。通过引入工程化二硫键，我们成功提升了阿达利姆单抗Fab的热稳定性，同时减少了其聚集倾向[25]、[26]。此外，在缺乏规则二级结构的柔性环区中，苯丙氨酸和脯氨酸等残基的替换也会显著影响Fab的整体热稳定性[27]。基于这些观察结果，本研究重点探讨了环区脯氨酸残基对Fab热稳定性的贡献，并系统分析了这些脯氨酸替换对Fab结构稳定性的影响。

章节节选

表达质粒的构建

为在酵母中重组表达阿达利姆单抗Fab，我们基于shuttle载体pPICZαA（Invitrogen公司，美国）构建了一个同时编码重链（Fab-H）和轻链（Fab-L）基因的共表达载体[28]。我们采用两步巨引物PCR法进行了位点定向突变[29]。为便于α因子信号肽的有效加工，我们在和基因的N端各添加了一个丝氨酸残基[30]。随后便得到了相应的Fab变异体。

脯氨酸替换为甘氨酸的变异体的特性分析

为探究阿达利姆单抗Fab H链中环区脯氨酸残基对其结构稳定性的影响，我们分别将V_H结构域中的Pro14和Pro41，以及C_H1结构域中的Pro210替换为甘氨酸，所得变异体分别命名为H:P14G、H:P41G和H:P210G。这些残基在Fab结构中的位置如图1所示。这些重组Fab变异体在酵母中表达后，被进一步纯化以便后续分析。

其二级结构

讨论

确定那些有助于提升Fab热稳定性的氨基酸残基，并理解其稳定机制，对于抗体工程而言具有重要意义。抗体具有由β-三明治结构构成的典型免疫球蛋白折叠结构，且包含多个环区[32]。这些局部结构元素的稳定性会显著影响整个分子的热稳定性及聚集倾向[33]。脯氨酸对其肽主链具有独特的结构约束作用

CRediT作者贡献说明

Takatoshi Ohkuri：撰写——审阅与编辑、项目监督、项目管理、方法学研究、资金获取、概念构思。Naoko Oda-Ueda：项目监督。Akiko Ishii-Watabe：撰写——审阅与编辑、项目监督。Masato Kiyoshi：撰写——审阅与编辑、结果验证、方法学研究、实验分析。Hitomi Nakamura：撰写——审阅与编辑、结果验证、方法学研究、数据整理。Ryosei Kawakami：撰写——初稿撰写、结果验证、方法学研究、实验分析、正式数据分析，

利益冲突声明

? 作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

我们要感谢Editage公司（www.editage.jp）对本文的英文润色工作。本研究还得到了日本学术振兴会KAKENHI项目的支持（项目编号：25K08933）

Ryosei Kawakami|Masato Kiyoshi|Hitomi Nakamura|Naoko Oda-Ueda|Akiko Ishii-Watabe|Takatoshi Ohkuri

日本熊本县西区池田4-22-1，总合大学药学部，邮编860-0082