嵌合体分析表明，NO敏感性的提高与GC-2结构域有关，而最大活性的提升则与GC-1结构域相关

《Biochemical Pharmacology》：Chimeric analysis links increased NO sensitivity to GC-2 domains and higher maximal activity to GC-1

　　摘要：可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）是一氧化氮（NO）的主要受体，能够催化cGMP的生成。哺乳动物中的sGC存在两种异二聚体亚型，即α1/β1和α2/β1，但二者在NO敏感性及催化效率方面的内在差异至今尚不完全清楚。本研究直接比较了HEK293细胞和Sf9细胞匀浆以及纯化酶制剂中这两种亚型对NO的依赖性激活情况。在细胞匀浆中，α1/β1表现出更高的最大NO刺激活性，而α2/β1则具有更强的NO敏感性。经过纯化后，这些差异显著减弱，仅表现为不显著的趋势，这说明NO依赖性激活受到细胞环境或辅因子的强烈影响。为确定其结构上的决定因素，我们构建了α亚基嵌合体，将α1和α2之间的H-NOX结构域、PAS结构域、卷曲螺旋结构域以及催化结构域进行交换。α2的H-NOX结构域提高了α亚基的蛋白含量，但降低了最大活性；而α2的H-NOX/PAS组合则进一步提升了NO敏感性。将α2的卷曲螺旋结构域引入α1亚基也增强了NO敏感性。催化结构域的交换结果显示，α1的催化结构域能提升催化效率，而α2的催化结构域则会限制这一效率。总体而言，这些数据表明，亚型特异性的NO依赖性激活特征是由多个α亚基结构域共同作用的结果，而非单一调控因子所致。我们的研究结果支持这样一种模型：α2/β1作为高敏感度的NO检测器，而α1/β1则作为低敏感性但高容量的信号放大器。本研究建立的嵌合体体系为未来研究sGC的别构调控及亚型选择性药理学提供了基础。

1. 引言
一氧化氮（NO）是一种普遍存在的信号分子，可调控多种生理过程，包括血管张力、血小板聚集以及神经传导等。它的主要受体是可溶性鸟苷酸环化酶（sGC），这是一种异二聚体酶，能够催化三磷酸鸟苷（GTP）转化为环磷酸鸟苷单核苷酸（cGMP），从而启动下游信号通路。哺乳动物中的sGC由一个α亚基和一个β亚基组成。α亚基存在α1和α2两种变异体，它们分别与共同的β1亚基结合，形成α1/β1（GC-1）和α2/β1（GC-2）两种sGC亚型。这两种亚型都具有保守的多结构域架构，依次为N端的血红素一氧化氮/氧结合结构域（H-NOX）、Per-Arnt-Sim结构域（PAS）、卷曲螺旋结构域（CC）以及C端的催化结构域。尽管其结构高度保守，但越来越多的证据表明，α1/β1和α2/β1具有不同的生理功能。这两种亚型在组织分布、亚细胞定位、遗传表型以及药理反应方面存在显著差异，说明它们并非功能上完全冗余[1]、[2]、[3]、[4]。α1/β1是大多数组织中占主导地位的亚型，在心血管系统中尤为重要，而α2/β1则在脑组织中较为丰富，与突触可塑性以及NMDA受体介导的信号传导有关[5]、[6]。然而，尽管存在这些生理差异，且NO作为内源性配体起着核心作用，但这两种亚型在NO依赖性激活特性方面的潜在内在差异至今仍不明确。现有研究较少，且结果存在矛盾：有些研究认为α1/β1和α2/β1的NO依赖性激活几乎没有差异[7]，而另一些研究则观察到了亚型特异性差异[8]、[9]、[10]。在本研究中，我们直接比较了HEK293细胞和Sf9细胞匀浆以及纯化酶制剂中α1/β1和α2/β1的NO依赖性激活特性。我们在细胞系统中发现了明显的亚型特异性差异，表现为NO敏感性和最大NO刺激下的催化活性不同。而在纯化酶制剂中，这些差异显著减弱，仅表现为不显著的趋势。为探究这些差异的结构基础，我们构建了一系列α亚基嵌合体，将α1和α2之间的不同结构域进行交换。对这些构建体的功能分析表明，亚型特异性的NO依赖性激活并非由单一的主导调控因子决定，而是多个α亚基结构域协同作用的结果。这些发现支持这样一种模型：NO敏感性和最大NO刺激下的催化活性是相互协调的属性，它们使得α1/β1和α2/β1能够共同扩展细胞对NO的感知范围，同时让每种亚型能够在主要暴露于较低或较高NO信号的细胞环境中独立发挥作用。

2. 材料与方法
2.1 材料
所有化学品均为最高纯度，除非另有说明，均购自Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆）。二硫苏糖醇（DTT）、乙二胺四乙酸（EDTA）、甘油和氯化钠购自AppliChem（德国达姆施塔特），十二烷基硫酸钠（SDS）则由Roth（德国卡尔斯鲁厄）提供。[α-32P]-GTP购自Hartmann Analytics（德国布伦瑞克）。限制性内切酶则从New England Biolabs（美国伊普斯威奇）获得。

2.2 构建体的克隆
此前已有的研究[11]中克隆了编码人类α1和β1亚基的pFASTBAC构建体，而相应的α2亚基构建体则由S?mmer等人描述[12]。用于纯化sGC的α亚基带有N端Strep标签；这些带Strep标签的α1和α2构建体的构建方法已在S?mmer等人的研究中详细描述[12]。对于HEK293细胞的瞬时转染，则使用了先前已构建的、编码人类α1和β1亚基的pcDNA3.1/V5/His-TOPO构建体，具体方法如前所述[13]。人类α2亚基最初由Harteneck等人克隆到pBR322载体中[9]，后来又被克隆到pcDNA3.1/V5/His-TOPO载体中。编码α亚基嵌合体的人工基因则由GeneArt（美国沃尔瑟姆的Thermo Fisher Scientific公司）在pcDNA3.1/V5/His-TOPO载体中合成。

2.3 HEK293细胞培养、sGC亚基的重组表达以及细胞匀浆的制备
HEK293细胞购自德国微生物与细胞培养物收集中心（DSMZ；编号ACC-305，RRID:CVCL_0045）。这些细胞在含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle高糖培养基（DMEM）中培养，培养条件为37℃、5%二氧化碳环境。实验所使用的细胞传代数为10至35代。在进行重组表达实验时，将5×10^6个细胞接种到容量为10毫升的100毫米培养皿中。接种24小时后，利用聚乙二醇胺将这些细胞与编码人类β1亚基的cDNA以及野生型或嵌合型α亚基一起进行瞬时转染。48小时后，通过刮取的方式将细胞分离出来，然后通过离心（757×g，2分钟）收集细胞。所得的细胞沉淀物被重新悬浮在裂解缓冲液中，该缓冲液由50mM三乙醇胺/HCl、10mM DTT和1mM EDTA组成，pH值为7.4，同时还添加了cOmplete?蛋白酶抑制剂混合物（罗氏公司，德国曼海姆）。随后通过超声处理破坏细胞结构，再将细胞匀浆在4℃下以2800×g的速度离心10分钟，以去除细胞碎片。

2.4 Sf9细胞培养、sGC亚基的重组表达以及细胞匀浆的制备
Sf9细胞（DSMZ编号ACC-125，RRID:CVCL_0549）在27℃、140转/分钟的条件下，以Sf-900? II无血清培养基（美国沃尔瑟姆的Thermo Fisher Scientific公司旗下的Gibco?产品）作为培养基进行悬浮培养。该培养基中也含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素。sGC亚基的重组共表达则是通过杆状病毒/Sf9表达系统实现的。重组杆状病毒的制备遵循《Bac-to-Bac?杆状病毒表达系统手册》（美国沃尔瑟姆的Thermo Fisher Scientific公司旗下的Invitrogen?公司出版）中的说明进行。72小时后，通过3028×g的速度离心2分钟收获Sf9细胞，然后按照与HEK293细胞相同的方法制备细胞匀浆。

2.5 蛋白质纯化
重组sGC的纯化方法参照Kraehling等人的先前研究[14]进行。简而言之，将Sf9细胞与分别编码TST-α1亚基和β1亚基、或S-α2亚基和β1亚基的重组杆状病毒共同感染。感染72小时后，通过离心收集细胞，然后将这些细胞重新悬浮在添加了cOmplete?蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液中。接着通过超声处理破坏细胞结构。离心后，将上清液依次通过0.45微米和0.2微米的过滤器，以去除残留的颗粒物质，之后再进行亲和层析纯化。纯化的蛋白质样品通过分子量截断值为30kDa的离心过滤装置（Amicon? Ultra-4离心过滤装置30K）进行浓缩。随后，将样品的最终浓度调整到25微克/毫升，所用缓冲液为由裂解缓冲液和甘油按9:1比例混合而成的检测用缓冲液，同时还添加了0.5毫克/毫升的牛血清白蛋白。将部分样品立即在液氮中速冻，然后储存在-80℃条件下，以备后续使用。

2.6 总蛋白测定、SDS-PAGE、Western Blotting以及考马斯亮蓝染色
在蛋白质纯化过程中获得的Sf9细胞胞质组分，以及HEK293细胞匀浆和Sf9细胞匀浆中的总蛋白浓度，都是以牛血清白蛋白为标准，采用Bradford法测定的。对于纯化后的蛋白质样品，则将其稀释在磷酸盐缓冲液（PBS；成分包括1.7mM KH2PO4、5.2mM Na2HPO4、150mM NaCl，pH值为7.4）中，然后与SDS样品缓冲液（成分包括50mM三羟甲基氨基甲烷（Tris）、100mM DTT、30%甘油、1% SDS，pH值为7.5）按1:1的比例混合。蛋白质在10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离，之后按照Kang等人的方法[15]，通过考马斯亮蓝染色进行可视化处理。通过Western Blot分析来检测细胞匀浆中重组sGC亚基的表达情况。样品与SDS样品缓冲液按1:1的比例混合，然后在99℃下加热3分钟，之后储存在-20℃条件下。进行Western Blot实验时，每条泳道中加入90微克的总蛋白，这些蛋白被转移到10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶上。电泳分离完成后，蛋白质被转移到硝酸纤维素膜上（产品为Amersham Protran Premium硝酸纤维素膜，编号为10600004，孔径为0.2微米；生产商为Cytiva，位于美国马尔伯勒）。为了确认蛋白质是否成功转移到膜上，先使用Ponceau S对膜进行可逆染色，然后在进行封闭处理之前对膜进行扫描。非特异性结合位点会在室温下、含有吐温20的Tris缓冲液（TBST；成分包括10mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.1%吐温20，pH值为8.0）中封闭1小时，该缓冲液中还添加了5%的低脂奶粉（用于印迹实验；生产商为德国卡尔斯鲁厄的Carl Roth公司）。用于检测相应sGC亚基的初级抗体如下：针对C端序列的α1抗体，稀释比例为1:5000，来自Sigma-Aldrich，编号为G4280，RRID为AB_259901；针对N端序列的α1抗体，稀释比例为1:1000，来自Thermo Fisher Scientific，编号为MA5-17086，RRID为AB_2538557；针对肽段LGSDYLETSPEEEGEC、EP073512以及PKPPKPSLSSSRIKKC、EP073513的α2抗体，这些抗体是由Eurogentech（比利时塞兰）制备并通过亲和纯化得到的；还有β1抗体，稀释比例为1:2000，来自Sigma-Aldrich，编号为G4405，RRID为AB_259906。这些初级抗体在TBST中稀释后，与膜在室温下孵育1.5至2小时。之后将膜用TBST洗涤三次，每次5至10分钟，然后再与二级抗体进行孵育。作为二级抗体，使用了过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体，稀释比例为1:2000，来自Cell Signaling Technology，编号为7074，RRID为AB_2099233；还有抗小鼠IgG抗体，稀释比例为1:2000，同样来自Cell Signaling Technology，编号为7076，RRID为AB_330924。这些二级抗体也在TBST中稀释后，与膜在室温下孵育30至45分钟。之后再次用TBST洗涤三次，每次10分钟，最后使用Lumi-LightPLUS（罗氏公司，德国曼海姆）进行化学发光检测。

2.7 sGC活性测定
cGMP生成活性是通过使用50纳克的纯化酶或者30微升的细胞匀浆来测定的。将样品在50mM TEA/HCl缓冲液中于37℃下孵育10分钟，该缓冲液的pH值为7.4，同时还添加了3mM DTT、1mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、0.5mM GTP、[α–32P]GTP、1mM cGMP、5mM磷酸肌酸、3mM MgCl2，以及每管10单位的磷酸肌酸激酶。反应结束后，依次加入500微升浓度为125mM的醋酸锌溶液和500微升浓度为120mM的碳酸钠溶液，这样就能使碳酸锌和5′-核苷酸发生共沉淀。在4℃下以18,000×g的速度离心9分钟后，使用氧化铝柱（Alumina N，产品型号为Activity: I，品牌为MP EcoChrom?，属于MP Biomedicals?公司，位于美国尔湾）来分离出放射性的cGMP。结合在氧化铝柱上的cGMP则用250mM pH值为6.5的醋酸钠溶液洗脱出来。放射性强度是通过Hidex 600 SL自动TDCR液体闪烁计数器（Hidex公司，位于芬兰图尔库）进行液体闪烁计数来测定的，计数时间为2分钟。酶活性会根据相应的总蛋白浓度进行标准化处理。在测定NO浓度与活性的关系时，Z-1-(N,N-二乙氨基)二嗪-1-ium-1,2-二醇二乙铵盐（DEA/NO）会在使用前立即溶解在10mM的NaOH溶液中。从1mM的储备溶液开始，通过连续10倍稀释的方式，得到最终浓度在0.1纳摩尔到100微摩尔之间的溶液。

2.8 数据与统计分析
数据以至少三个独立实验的平均值±标准差的形式呈现。在sGC活性测定中，每个样本都会进行两次测量，每次测量的数值会被平均，从而得到每个独立实验的平均值。曲线拟合和统计分析则是使用GraphPad Prism软件（位于美国拉霍亚）来完成的。各个α亚基的Western Blot信号则通过ImageJ软件进行密度定量分析。在扣除背景信号后，这些信号会根据相应的总蛋白加载对照物（Ponceau S）进行标准化处理，然后与同时检测的相应野生型基因的表达水平进行比较。相对表达值会经过对数变换处理，之后通过单样本t检验与0进行比较，其中0表示相对于野生型的表达水平没有变化。对于那些α亚基表达有显著变化的构建体，其活性值会根据相应的相对α亚基表达水平进行标准化处理，从而得到经过表达校正后的活性数据。在比较两组数据时，会使用非配对双尾Student’s t检验。浓度-响应曲线则通过双因素方差分析来进行比较，之后再使用?ídák多重比较检验法。当p值小于0.05时，差异被认为具有统计学显著性。

3. 结果α1/β1与α2/β1在NO依赖性激活方面的差异特性为了解决关于这两种异二聚体型sGC亚型在NO作用下激活机制的矛盾研究结果，我们比较了α1/β1和α2/β1在三种实验系统中的cGMP生成活性：HEK293细胞匀浆、Sf9细胞匀浆以及从Sf9细胞中纯化的酶制剂。对于细胞匀浆，我们使用了浓度范围为0.1?nM至10?μM的DEA/NO；而对于纯化后的酶制剂，则使用0.1?nM至100?μM的浓度范围来绘制浓度-响应曲线（见图1）。表1汇总了各亚型的基础活性、EC50值及Vmax值。下载：高分辨率图像（433KB）下载：全尺寸图像图1. 在转染过的HEK293细胞匀浆、经杆状病毒感染的Sf9细胞匀浆以及纯化酶制剂中，DEA/NO对α1/β1和α2/β1的激活作用差异。(A) HEK293细胞被暂时转染编码α1/β1或α2/β1的cDNA，转染48小时后制备细胞匀浆。在0.1?nM至10?μM的不同DEA/NO浓度下测定鸟苷酸环化酶活性。(B) (A)中的数据以10?μM DEA/NO条件下的活性为基准，设定为100%进行标准化处理。(C) Sf9细胞被感染编码α1/β1或α2/β1的重组杆状病毒，感染72小时后制备细胞匀浆，并按照1A中的方法测定鸟苷酸环化酶活性。(D) (C)中的数据同样以10?μM DEA/NO条件下的活性为基准进行标准化处理。(E) 在Sf9细胞中表达带有Strep标签的α1/β1或α2/β1蛋白，随后通过亲和层析技术进行纯化。在0.1?nM至100?μM的不同DEA/NO浓度下测定其鸟苷酸环化酶活性。(F) 图1F展示了HEK293细胞和Sf9细胞中转染后sGC α亚基与β亚基的表达情况。这些Western blot图用于作为活性测定样本的蛋白质表达对照。需注意，Sf9细胞匀浆中β1亚基的表达是在两张不同的凝胶上进行分析的。所有数据均为4至10次独立实验的平均值±标准差。统计显著性是通过双因素方差分析结合?ídák多重比较检验来判断的。在相应DEA/NO浓度下存在显著差异时，分别用***（p?≤?0.001）和****（p?≤?0.0001）标示。表1. 图1中所展示的不同实验体系中的sGC亚型的基础活性、EC50值及Vmax值。该表列出了在没有DEA/NO存在时的基础活性（单位：pmol cGMP mg?1 min?1），以及根据图1中的浓度-响应曲线得出的EC50值（单位：nM DEA/NO）和Vmax值（单位：nmol cGMP mg?1 min?1）。所有数值均为平均值±标准差。第一行数据来自HEK293细胞匀浆的活性测定结果（图1A）；第二行数据来自Sf9细胞匀浆的测定结果（图1C）；第三行数据来自纯化蛋白制剂的测定结果（图1E）。每行数据还按所检测的亚型进一步细分。统计显著性是通过非配对Student’s t检验来判断的。不同亚型之间的显著差异分别用*(p?≤?0.05)、**(p?≤?0.01)、***（p?≤?0.001）和****（p?≤?0.0001）标示。空白单元格基础活性（pmol cGMP mg?1 min?1）±标准差EC50（nM）±标准差Vmax（nmol cGMP mg?1 min?1）±标准差HEK293细胞匀浆α1/β121.2?±?4.8298?±?1361.7?±?0.9α2/β112.0?±?6.2 **114?±?50 ***0.32?±?0.16 ****Sf9细胞匀浆α1/β1188?±?351500?±?25119.1?±?2.8α2/β177.5?±?38.5 **641?±?79 ****4.2?±?1.9 ****纯化酶制剂α1/β181.9?±?89.51816?±?3274516?±?561α2/β115.7?±?24.4 *1609?±?2603041?±?1108无论是在HEK293细胞匀浆（图1A、B）还是Sf9细胞匀浆（图1C、D）中，α1/β1都表现出显著更高的NO刺激下的最大活性（Vmax）。相比之下，α2/β1在两种细胞系统中均显示出较低的EC50值，这说明其与α1/β1相比对NO更为敏感。这种在NO敏感性上的差异在HEK293细胞匀浆的标准化浓度-响应曲线中尤为明显（见图1B），在Sf9细胞匀浆中也能观察到类似趋势，不过后者中的差异稍显不那么显著（见图1D）。在纯化酶制剂中（图1E），两种亚型都需要更高的DEA/NO浓度才能使浓度-响应曲线达到饱和状态，因此最大DEA/NO浓度被设定为100?μM。与细胞匀浆相比，α1/β1和α2/β1之间的EC50和Vmax差异明显减小，且未达到统计学上的显著水平。尽管如此，纯化酶制剂仍显示出与细胞系统相似的趋势：α1/β1的最大活性有上升趋势，而α2/β1的EC50值则有下降趋势。在细胞匀浆和纯化酶制剂中，α1/β1的基础活性始终高于α2/β1（见表1）。所有参与活性测定的样本都进行了Western blot分析，典型的分析结果如图1F所示。由于缺乏通用的α亚基抗体，无法直接比较α1和α2的表达水平，但各实验组间的β1亚基表达水平则基本相当。3.2 α亚基嵌合体的构建与设计为进一步探究α1/β1与α2/β1在功能上的差异及其结构基础，我们构建了一系列α亚基嵌合体，通过在这些嵌合体中交换α1和α2中的特定结构域来实现。图2A展示了sGC的整体结构域组成，包括H-NOX结构域、PAS结构域、CC结构域以及催化结构域。基于这一结构框架，我们通过在α1和α2相应位置交换特定结构域来构建嵌合α亚基（见图2B）。这些嵌合体根据其α亚基的结构域来源进行命名，“1”表示源自α1的结构域，“2”则表示源自α2的结构域。例如，α2111嵌合体包含源自α2的H-NOX结构域，以及源自α1的PAS结构域、CC结构域和催化结构域。图2C则展示了用于与野生型α1/β1对比的基于α1的嵌合体。相应的基于α2的嵌合体也是通过类似方法构建的，然后与野生型α2/β1进行比较。下载：高分辨率图像（231KB）下载：全尺寸图像图2. sGC的结构域架构及α亚基嵌合体的设计。(A) 人类sGC的示意图，展示了其包含H-NOX结构域、PAS结构域、CC结构域和催化结构域的整体结构。α亚基以绿色显示，β亚基以灰色显示。辅基血红素群和底物GTP在其结合位点处有标记。右侧为基于现有冷冻电镜结构构建的异二聚体结构模型。(B) α1和α2亚基的序列比对图，标出了为构建嵌合体而进行结构域交换的位置。α1亚基以蓝色显示，α2亚基以黄色显示。(C) 本研究中使用的基于α1的嵌合体，其中特定的结构域已被替换为α2对应的结构域。相应的基于α2的嵌合体也是通过类似方法构建的。3.3 H-NOX结构域的交换会影响α亚基的表达或稳定性，并在表达校正后对sGC活性产生相反的影响首先，我们通过分析交换了α1和α2之间H-NOX结构域的嵌合体，来研究N端调控区域的作用。图3展示了经过总蛋白标准化后的浓度-响应曲线、相应的Western blot分析结果以及经过表达校正后的活性数据。总蛋白标准化活性测定所得的基础活性、EC50值和Vmax值汇总在表2中，而相对表达水平及经过表达校正后的活性参数则列于表3。相应的嵌合体结构在总蛋白标准化浓度-响应曲线上方以示意图形式呈现。下载：高分辨率图像（318KB）下载：全尺寸图像图3. H-NOX结构域被交换后的α亚基嵌合体的NO依赖性激活情况。HEK293细胞被暂时转染编码相应野生型或嵌合型α亚基的cDNA，同时表达β1亚基。48小时后，制备细胞匀浆，并检测其在不同浓度DEA/NO（0.1?nM–10?μM）作用下的sGC活性。相应的嵌合体结构以示意图形式展示在图表上方。(A)、(B) 为交换了H-NOX结构域的嵌合体的浓度-响应曲线：α2111/β1与α1/β1的对比（A），以及α1222/β1与α2/β1的对比（B）。(C)、(D) 为HEK293细胞中转染后sGC α亚基和β亚基表达情况的典型Western blot图。相对α亚基表达水平的量化结果汇总在表3中。(E)、(F) 为根据A和B组数据得到的经过表达校正后的浓度-响应曲线。所有数据均为至少3次独立实验的平均值±标准差。统计显著性是通过双因素方差分析结合?ídák多重比较检验来判断的。在相应DEA/NO浓度下存在显著差异时，分别用*(p?≤?0.05)、**(p?≤?0.01)、***（p?≤?0.001）和****（p?≤?0.0001）标示。表2. 图3A、B以及图4A、B中所展示的嵌合体的基础活性、EC50值和Vmax值。该表列出了在没有DEA/NO存在时的基础活性（单位：pmol cGMP mg?1 min?1），以及根据图3A、B和图4A、B中的浓度-响应曲线得出的EC50值（单位：nM DEA/NO）和Vmax值（单位：nmol cGMP mg?1 min?1）。所有数值均为平均值±标准差。相对表达水平的统计分析是通过将对数变换后的相对表达值与0进行单样本t检验来完成的，0代表与野生型相比表达水平没有变化。经过表达校正后的基础活性和Vmax值则是通过与相应野生型酶进行非配对双尾Student’s t检验来比较的。与相应野生型相比存在显著差异时，分别用*(p?≤?0.05)、**(p?≤?0.01)、***（p?≤?0.001）和****（p?≤?0.0001）标示。空白单元格相对表达水平经过表达校正后的基础活性（单位：pmol cGMP mg?1 min?1）±标准差经过表达校正后的Vmax值（单位：nmol cGMP mg?1 min?1）±标准差α1/β1121.2?±?4.81.7?±?0.9α2111/β12.72?±?0.97 *6.7?±?3.2 ***0.63?±?0.43α2211/β12.32?±?0.73 *34.3?±?25.50.28?±?0.14 **α2/β1112.0?±?6.20.32?±?0.16α1222/β10.25?±?0.06 *135.5?±?66.9 ****1.78?±?1.02 ***α1122/β10.21?±?0.09 **68.7?±?22.7 ****1.89?±?0.33 ****在以总蛋白为基准进行活性校正后，α2111/β1嵌合体的浓度-响应曲线相比α1/β1出现了小幅但显著的向右偏移，而其最大活性则基本保持不变（见图3A）。相反，对应的α1222/β1嵌合体则出现类似的小幅但显著的向左偏移，其最大活性也同样没有明显变化（见图3B）。Western blot分析显示，不同嵌合体在α亚基的表达水平上存在显著差异（见图3C、D）。α2111嵌合体中的α亚基蛋白水平显著高于野生型α1，而对应的α1222嵌合体中的α亚基蛋白水平则明显低于野生型α2。相应的β1亚基的Western blot结果并未显示出野生型与嵌合体之间存在明显差异，也未受到α亚基表达变化的影响。为了解释这些差异，我们根据每种嵌合体相对于相应野生型α亚基的表达水平，对浓度-响应曲线进行了调整（见图3E、F）。这样一来，仅交换H-NOX结构域就导致了基础活性和最大活性出现显著且相反的变化，此外EC50值也出现了变化。与野生型α1/β1相比，α2111/β1嵌合体的基础活性显著降低，Vmax则仅有轻微下降。而经过表达水平校正后，α1222/β1嵌合体的Vmax和基础活性则显著高于野生型α2/β1。3.4 同时交换H-NOX和PAS结构域会显著改变α1/β1的活性接下来，我们分析了同时交换了α1和α2之间H-NOX结构域和PAS结构域的嵌合体。图4展示了经过总蛋白标准化后的浓度-响应曲线、相应的Western blot分析结果以及经过表达校正后的活性数据。总蛋白标准化活性测定所得的基础活性、EC50值和Vmax值汇总在表2中，相对表达水平及经过表达校正后的活性参数则列于表3。相应的嵌合体结构在总蛋白标准化浓度-响应曲线上方以示意图形式呈现。下载：高分辨率图像（319KB）下载：全尺寸图像图4. H-NOX/PAS结构域被交换后的α亚基嵌合体的NO依赖性激活情况。HEK293细胞被暂时转染编码相应野生型或嵌合型α亚基的cDNA，同时表达β1亚基。48小时后，制备细胞匀浆，并检测其在不同浓度DEA/NO（0.1?nM–10?μM）作用下的sGC活性。相应的嵌合体结构以示意图形式展示在图表上方。(A)、(B) 为同时交换了H-NOX/PAS结构域的嵌合体的浓度-响应曲线：α2211/β1与α1/β1的对比（A），以及α1122/β1与α2/β1的对比（B）。(C)、(D) 为HEK293细胞中转染后sGC α亚基和β亚基表达情况的典型Western blot图。相对α亚基表达水平的量化结果汇总在表3中。(E)、(F) 为根据A和B组数据得到的经过表达校正后的浓度-响应曲线。所有数据均为至少3次独立实验的平均值±标准差。统计显著性是通过双因素方差分析结合?ídák多重比较检验来判断的。在相应DEA/NO浓度下存在显著差异时，分别用***（p?≤?0.001）和****（p?≤?0.0001）标示。α2211/β1嵌合体的总蛋白标准化浓度-响应曲线出现了明显的向左偏移，同时其最大活性也有所下降（见图4A），这体现在EC50值和Vmax值均显著降低。值得注意的是，该构建体还表现出显著升高的基础活性（表2）。相比之下，反向的α1122/β1构建体与野生型α2/β1极为相似，其EC50值和最大活性均无显著变化（图4B）。与相应的仅含H-NOX的嵌合体类似，在进一步替换PAS结构域后，α亚基的表达模式依然保持不变（图4C,D）。西方印迹分析显示，α2211嵌合体的α亚基蛋白水平高于野生型α1，而反向的α1122嵌合体的α亚基蛋白水平则显著低于野生型α2。同样，β1蛋白水平在野生型与嵌合体构建体之间基本一致。这些嵌合体的浓度-反应曲线是根据各嵌合体相对于相应野生型α亚基的表达水平进行校正的（图4E,F）。经过标准化处理后，α2211/β1的最大活性降低现象更为明显。相反，反向的α1122/β1嵌合体的活性曲线在经过表达校正后与H-NOX嵌合体（α1222/β1）的曲线相似，其Vmax值和基础活性均显著高于野生型α2/β1。不过，与α1222/β1不同，α1122/β1的EC50值不再出现降低现象（表2）。3.5. 替换卷曲螺旋结构域可选择性改变α1/β1的NO敏感性和基础活性接下来，我们通过分析在α1和α2之间交换CC结构域的反向嵌合体，来研究CC结构域的作用。图5展示了经总蛋白标准化后的浓度-反应曲线、响应标准化后的浓度-反应曲线、基础活性数值以及相应的西方印迹分析结果。相应的活性数值汇总于表4，而相对表达水平及经过表达校正的参数则列于表5。这些嵌合体构建体以示意图形式展示在各自的总蛋白标准化浓度-反应曲线上方。下载：下载高分辨率图像（351KB）下载：下载全尺寸图像图5. 替换CC结构域后α亚基嵌合体的NO依赖性激活。HEK293细胞被短暂转染了编码相应野生型或嵌合体α亚基的cDNA，同时表达β1亚基。48小时后，制备细胞匀浆，并检测其在不同浓度的DEA/NO（0.1 nM–10 μM）作用下的sGC活性。所分析的嵌合体以示意图形式展示在相应图表的上方。（A,B）分别比较α1/β1与α1121/β1（A），以及α2/β1与α2212/β1（B）的浓度-反应曲线。（C,D）将（A,B）中的数据以10 μM DEA/NO条件下的活性为基准进行标准化，该值设为100%。（E）在无DEA/NO存在的情况下，比较α1/β1与α1121/β1的基础sGC活性。（F）展示HEK293细胞中转染的sGC α亚基和β亚基表达情况的代表性西方印迹图。相对α亚基表达量的量化结果汇总于表5。所有数据均为至少三组独立实验的平均值±标准差。统计显著性通过非配对学生t检验来判断。与相应野生型相比有显著差异的结果用****表示（p ≤ 0.0001）。表4. 图5A,B和6A,B中所展示构建体的基础活性、EC50值和Vmax值。该表列出了在无DEA/NO存在时测得的基础活性（pmol cGMP mg?1 min?1），以及根据图5A,B和6A,B中的DEA/NO浓度-反应曲线得出的EC50值（nM DEA/NO）和Vmax值（nmol cGMP mg?1 min?1）。所有数值均为平均值±标准差。统计显著性通过非配对学生t检验来判断。与相应野生型相比有显著差异的结果分别用*（p ≤ 0.05）、**（p ≤ 0.01）和****（p ≤ 0.0001）表示。空白单元格基础活性（pmol cGMP mg?1 min?1）±标准差EC50（nM）±标准差Vmax（nmol cGMP mg?1 min?1）±标准差a1/β1 21.2 ± 4.8 298 ± 136 169 ± 0.85a1121/β1 124 ± 48 **** 38.7 ± 27.8 ** 1.79 ± 0.81a1112/β1 8.1 ± 6.0 ** 344 ± 246 0.16 ± 0.01 *a2/β1 12.0 ± 6.2 114 ± 50 0.32 ± 0.16a2212/β1 15.6 ± 14.0 7.5 ± 27.3 0.20 ± 0.04a2221/β1 35.7 ± 6.4 **** 72.3 ± 76.1 0.50 ± 0.19表5. 图5E,F和6E,F中所展示构建体的相对表达水平及经过表达校正的活性参数。相对α亚基表达量是以相应野生型构建体为基准进行标准化的，后者值设为1。经过表达校正后的基础活性以pmol cGMP mg?1 min?1为单位，而经过表达校正后的Vmax值则以nmol cGMP mg?1 min?1为单位。所有数值均为平均值±标准差。对于表达水平的统计分析，首先对相对表达量进行对数转换，然后通过单样本t检验与0进行比较，其中0对应于相对于野生型表达水平未发生改变的情况。经过表达校正后的基础活性和Vmax值则通过非配对双尾学生t检验与相应野生型酶进行比较。与相应野生型相比有显著差异的结果分别用*（p ≤ 0.05）、**（p ≤ 0.01）和****（p ≤ 0.0001）表示。空白单元格相对表达量经过表达校正的基础活性（pmol cGMP mg?1 min?1）±标准差经过表达校正的Vmax值（nmol cGMP mg?1 min?1）±标准差a1/β1 121.2 ± 4.8 1.7 ± 0.9a1121/β1 1.14 ± 0.28 99.1 ± 47.3 **** 1.5 ± 0.8a1112/β1 0.43 ± 0.07 ** 20.6 ± 14.0 0.60 ± 0.34 *a2/β1 112.0 ± 6.2 0.32 ± 0.16a2212/β1 1.33 ± 0.20 12.4 ± 16.1 0.40 ± 0.22a2221/β1 0.88 ± 0.04 * 39.7 ± 9.3 **** 0.56 ± 0.18 *用α1来源的CC结构域替换为相应的α2结构域后（α1121/β1），与野生型α1/β1相比，DEA/NO浓度-反应曲线出现明显的左移，而最大活性则保持不变（图5A）。相反，基于α2的反向嵌合体（α2212/β1）与野生型α2/β1的差异较小，其EC50值和Vmax值均无显著变化（图5B）。将浓度-反应曲线以10 μM条件下的活性为基准进行标准化后，α1121/β1的左移现象更加明显，而α2212/β1则仍与野生型α2/β1极为相似（图5C,D）。在无DEA/NO存在的条件下测定的基础活性进一步显示出CC结构域交换的额外影响。基于α1的CC嵌合体α1121/β1在所有构建体中展现出最高的基础活性（图5E）。相反，基于α2的反向构建体α2212/β1则与野生型α2/β1非常接近（表4）。图5F展示了代表性的西方印迹图。密度测定并未发现CC结构域嵌合体与相应野生型酶之间的α亚基蛋白水平存在显著差异。因此，这些构建体没有展示经过表达校正后的浓度-反应曲线。为证明α亚基表达并非导致所观察到的活性差异的原因，表5中给出了经过表达校正后的活性参数。3.6. 替换催化结构域主要影响最大活性最后，我们通过分析在α1和α2之间交换催化区域所得到的嵌合体，来研究C端催化结构域的作用。图6展示了经总蛋白标准化后的浓度-反应曲线、相应的西方印迹分析结果以及经过表达校正后的活性数据。总蛋白标准化活性测量所得的基础活性、EC50值和Vmax值汇总于表4，而相对表达水平及经过表达校正的活性参数则列于表5。这些嵌合体构建体以示意图形式展示在各自的总蛋白标准化浓度-反应曲线上方。下载：下载高分辨率图像（315KB）下载：下载全尺寸图像图6. 替换催化结构域后α亚基嵌合体的NO依赖性激活。HEK293细胞被短暂转染了编码相应野生型或嵌合体α亚基的cDNA，同时表达β1亚基。48小时后，制备细胞匀浆，并检测其在不同浓度的DEA/NO（0.1 nM–10 μM）作用下的sGC活性。所分析的嵌合体以示意图形式展示在相应图表的上方。（A,B）分别比较α1/β1与α1112/β1（A），以及α2/β1与α2221/β1（B）的浓度-反应曲线。（C,D）展示HEK293细胞中转染的sGC α亚基和β亚基表达情况的代表性西方印迹图。相对α亚基表达量的量化结果汇总于表5。（E,F）为图A和B中测量结果对应的经过表达校正后的浓度-反应曲线。所有数据均为至少三组独立实验的平均值±标准差。统计显著性通过双因素方差分析结合?ídák多重比较检验来判断。在相应DEA/NO浓度下有显著差异的结果分别用*（p ≤ 0.05）、**（p ≤ 0.01）、***（p ≤ 0.001）和****（p ≤ 0.0001）表示。在总蛋白标准化测量中，用α1来源的催化结构域替换为相应的α2结构域后（α1112/β1），与野生型α1/β1相比，其基础活性以及DEA/NO刺激下的最大活性均显著降低，而EC50值则基本保持不变（图6A）。相反，含有α1催化结构域的基于α2的反向嵌合体（α2221/β1）的基础活性显著高于野生型α2/β1，同时Vmax值也有轻微但不显著的上升。EC50值则无显著变化（图6B）。西方印迹分析显示，野生型与嵌合体构建体之间的α亚基蛋白水平存在显著差异，两种嵌合体的α亚基蛋白水平均低于相应的野生型。不过，这些差异相较于H-NOX和H-NOX/PAS结构域交换后的嵌合体要轻微得多（图6C,D及表5）。同样，β1蛋白水平在野生型与嵌合体构建体之间基本一致。为弥补α亚基表达水平的差异，这些嵌合体的浓度-反应曲线是根据各嵌合体相对于相应野生型α亚基的表达水平进行校正的（图6E,F）。这样一来，α1112/β1的Vmax降低现象虽有所减轻，但仍具有统计学显著性，而基础活性的差异则不再能够被检测到（表5）。相反，对α2221/β1嵌合体进行标准化处理后，其与野生型α2/β1的最大活性差异进一步增大，导致其Vmax值显著上升。4. 讨论本研究直接对比了两种sGC亚型——α1/β1和α2/β1，并确定了那些影响它们在NO作用下游离激活特性差异的α亚基结构域。通过结合纯化酶制剂和细胞匀浆中的分析方法以及系统性的α亚基嵌合体研究策略，我们解决了文献中存在的矛盾观点，明确了各个结构域在基础活性、NO敏感性以及最大NO刺激活性方面的具体作用。4.1. 通过嵌合体分析对α亚基结构域的功能解析尽管α亚基间的序列同源性仅约为47% [16]，但它们仍具备足够的结构兼容性，能够形成具有催化活性的嵌合酶，这体现了sGC整体结构域架构的高度保守性。然而，结构域交换会对不同构建体中的α亚基蛋白水平产生影响。因此，我们采用了西方印迹分析以及基于表达水平的标准化处理方法，以便区分催化特性的变化与蛋白水平的变化。结构域互换策略已被成功应用于其他多结构域酶的研究，用于确定各区域的具体功能特性 [17]、[18]。与删除突变体不同，后者会去除整个结构元件，而嵌合体构建体则保留了酶的整体结构域组织，从而能够在全长蛋白的背景下研究内部蛋白质区域。据我们所知，这是首次将这种方法系统地应用于sGC亚型研究。除了分析亚型特异性的信号传导特性外，这里建立的嵌合体体系还为未来研究化合物作用位点、别构通讯途径以及决定亚型选择性药理特性的研究提供了有益的框架。4.2. 亚型特异性的NO依赖性激活取决于实验条件早期使用细胞表达系统的研究表明，在细胞匀浆中，α1/β1的最大NO刺激活性高于α2/β1。Harteneck等人 [9] 在COS细胞中通过CMV启动子驱动表达牛源α1/β1与由人源α2和牛源β1组成的混合α2/β1酶，得出了类似结论；Behrends等人 [10] 在Sf9细胞中通过杆状病毒介导表达相同亚基也得到了相同结果。后来，Bellingham和Evans [8] 在CHO-K1细胞中使用NO供体精胺NONOate，通过CMV启动子驱动表达人源亚基，同样观察到α1/β1的最大活性显著高于α2/β1。在同一研究中，α2/β1的EC50值也略低于α1/β1，不过这一差异并未达到统计学显著性。在本研究中，我们在两种细胞表达系统中证实了人源α1/β1与α2/β1的最大活性存在差异：即在暂时转染的HEK293细胞和经杆状病毒感染的Sf9细胞中。此外，我们还发现，在这两种系统中，α2/β1的NO敏感性均显著高于α1/β1，而在HEK293细胞匀浆中这种差异尤为明显。这可能是由于HEK293细胞中表达的sGC含有更高的血红素含量，而Sf9细胞则不然 [19]。与不同研究小组在各种细胞系统中发现的亚型间明显差异不同，在纯化酶制剂中并未检测到NO依赖性激活特性的显著差异：Russwurm等人 [7] 未发现纯化的牛源α1/β1与由人源α2和牛源β1组成的纯化混合α2/β1酶之间存在功能差异。我们对纯化的人源α1/β1和α2/β1进行的比较也表明，经过纯化处理后，亚型间在最大NO刺激活性和NO敏感性方面的差异显著减弱，且不再具有统计学显著性，而α2/β1较低的基础活性则依然存在。纯化处理后NO相关差异的减弱表明，细胞内的各种因素，如辅因子、翻译后修饰、氧化还原状态或蛋白-蛋白相互作用，可能会放大细胞制剂中固有的亚型特异性特征。此前已有研究指出，这些因素都会影响sGC的活性 [20]、[21]。重要的是，这种解释似乎仅适用于NO依赖性调控，因为我们之前已经观察到，在纯化制剂和细胞系统中，sGC激活剂引发的激活作用仍能保持亚型间的差异 [4]。α亚基表达水平的差异可能解释了为何在细胞匀浆中观察到的α2/β1最大活性较低。由于目前还没有能同时以相当灵敏度识别两种α亚基的抗体，因此这些制剂中的活性只能以总蛋白量为基准进行标准化，而非以sGC蛋白含量为基准。尽管如此，不同细胞表达系统中α2/β1的最大活性持续较低这一现象，表明其最大催化输出存在可重复的亚型特异性差异[8]、[9]、[10]。表达差异无法解释细胞匀浆中α2/β1的更低EC50值，因为由浓度-反应曲线得出的NO敏感性应与蛋白质的绝对含量无关。4.3 H-NOX结构域的缺失会影响α亚基的表达或稳定性与β1的H-NOX结构域不同，α1的H-NOX结构域不与血红素结合，因此此前被称作伪H-NOX结构域[22]、[23]。删除α1的H-NOX结构域后，其与β1形成的异二聚体出人意料地稳定，且与典型形式相比没有明显的生化差异[14]、[24]。缺乏H-NOX结构域的C-α1剪接形式表明，在人类胚胎干细胞分化过程中，H-NOX结构域缺失的变体可能具有内在作用[25]、[26]。相反，从α2亚基中删除相应的H-NOX结构域后，所得异二聚酶的最大活性和稳定性显著下降[27]。与重要的稳定作用一致，α2的H-NOX结构域使得α2111构象中的α亚基水平升高，而在α2亚基中替换该结构域则降低了α1222构象中的α亚基蛋白水平。在归一化到相应野生型α亚基水平后，单独的H-NOX结构域交换实验显示出对sGC活性的相反影响：α2111/β1的基础活性和Vmax降低，而α1222/β1的基础活性和Vmax则显著升高。结合上述已发表的结果，这些发现表明α2的H-NOX结构域能提高蛋白质的表达或稳定性，同时限制催化输出。相比之下，α1的H-NOX结构域在α1/β1中似乎并非必需[14]、[24]、[25]、[26]，但在主要由α2区域构成的嵌合体（α1222/β1）中却能提升活性。4.4 PAS结构域可调节NO敏感性和最大活性PAS结构域被广泛认为是sGC的核心调控模块，它有助于各结构域间的通信、酶的组装，以及将配体结合与催化激活相连接[28]、[29]、[30]。同时替换H-NOX和PAS结构域会产生明显且不对称的效果。将α2来源的H-NOX和PAS区域引入α1骨架后，NO敏感性显著提高，而最大活性则大幅降低。这些变化使基于α1的嵌合体更接近α2/β1的关键功能特征，表明亚型特异性信号传导的主要决定因素就编码在这一调控区域中。有趣的是，这种敏感性的提升与先前的观点一致，即α1的PAS结构域可能会降低血红素位点对配体的亲和力[23]、[31]。仅含H-NOX结构域和含H-NOX/PAS结构域的嵌合体所观察到的相似α亚基表达模式进一步表明，蛋白质水平的改变主要与被替换的H-NOX区域有关，而不受PAS结构域的进一步影响。4.5 螺旋卷曲结构域对NO敏感性和基础活性的影响CC结构域被广泛认为是sGC的核心结构元素，它将N端的调控结构域与C端的催化模块相连，并传递由配体结合引发的构象变化[23]、[30]。因此，该区域的改变预计会影响酶从非活性状态向活性状态的构象转变，进而影响NO敏感性和基础活性，而非最大催化能力。与这一作用一致，将α2来源的CC结构域引入α1骨架后，NO浓度-反应曲线明显左移，基础活性上升，而最大活性保持不变。这些发现表明，α2的CC区域通过破坏低活性的静息状态或稳定活性构象，使酶更容易处于活化状态。这与一些研究结果一致，即CC区域的改变可使sGC趋向活化状态，包括那些不再需要激动剂刺激就能持续活化的变体[32]。有趣的是，用相应的α1区域替换α2的CC结构域后，仍基本保持了α2/β1的表型。与PAS结构域交换实验类似，这种不对称性表明CC结构域的作用在很大程度上取决于其所处的结构背景，不能脱离邻近结构域单独解读。4.6 催化结构域在亚型特异性最大活性中的作用α和β亚基的C端催化结构域构成了sGC的复合活性位点，因此是决定cGMP生成能力的关键因素[33]。与这一观点一致，我们在嵌合体构建中进行的催化结构域交换主要改变了最大活性，而NO敏感性基本保持不变。α2来源的催化结构域使得α1112/β1的最大活性显著降低，其Vmax值也远低于野生型α1/β1。相反，将α1的催化结构域引入α2背景后，最大活性显著上升。这些相反的效果强烈表明，α亚基催化结构域内的功能差异在很大程度上导致了不同天然亚型之间最大活性的差异。4.7 亚型特异性NO依赖性激活特征的生理意义α1/β1与α2/β1在NO敏感性、基础活性及最大催化输出方面的差异表明，这两种亚型并非简单的冗余NO受体，而是为不同的NO浓度环境优化的独立信号传导模块。在大多数组织中，尤其是心血管系统中，α1/β1是占主导地位的亚型，因为在这些部位需要快速且大规模的cGMP生成才能实现有效的血管舒张反应[34]、[35]。相比之下，α2/β1的NO敏感性更高，但最大催化活性和基础活性较低。这种组合可能特别适合于NO信号在空间上受到限制且调控严格的细胞环境，如神经元信号微域。事实上，α2/β1在中枢神经系统的特定区域表达较多，而在这些区域，NO-cGMP信号通路参与了包括NMDA受体介导的信号传导和长时程增强在内的多种生理过程[5]、[6]。从系统角度而言，将高NO敏感性与有限的cGMP最大生成量相结合，可能是一种重要的功能设计原则。如果存在一种与α1/β1具有相同最大信号传导能力的高NO敏感性亚型，那么它在大部分生理范围的NO浓度下都可能主导细胞的cGMP响应，从而降低系统区分弱强NO信号的能力。从这个意义上说，α2/β1可能是一种针对弱NO信号的高灵敏度检测器，而α1/β1则可能是一种灵敏度较低但信号放大能力更强的信号放大器。其他信号蛋白和离子转运系统也存在类似的平衡关系，比如SERCA亚型和IP3受体亚型，它们的不同动力学特性是与不同的生理需求相匹配的[36]、[37]。因此，α1/β1和α2/β1的共存可能使细胞能够在更广泛的功能范围内解析空间和时间上的NO梯度，同时既保持对弱NO信号的敏感性，又能在高NO浓度下产生强烈的cGMP响应。4.8 实验考虑因素与局限性本研究采用的嵌合体方法能够在保留异二聚酶整体结构的同时，对特定结构域的功能进行分析。重要的是，所有嵌合体构建体都保留了较强的NO刺激活性，这表明被交换的结构域在结构上是兼容的，且尽管发生了结构域替换，酶的整体完整性仍基本得以保持。不过，在解读结构域交换实验时需谨慎，因为sGC中的结构域间通信很可能依赖于精细调控的结构相互作用，而这些相互作用在嵌合酶中可能无法完全维持。此外，虽然细胞匀浆实验可能保留了纯化蛋白制剂中所没有的细胞内环境特征，但它仍然属于简化的实验系统。在体内环境中，亚型特异性的sGC行为还可能受到区室化信号传导、局部NO梯度、磷酸二酯酶活性、氧化还原调控、蛋白质-蛋白质相互作用以及组织特异性表达模式的影响。因此，未来在更复杂的细胞和组织系统中开展的研究将有助于明确α1/β1和α2/β1的不同信号传导特性是如何在自然条件下参与生理过程的NO信号解码的。5. 结论总体而言，我们的数据支持这样一种模型：内在的亚型特异性特征与外在的细胞调控机制相互协作，共同决定了这两种异二聚体sGC亚型不同的NO信号传导行为。在细胞匀浆中，α1/β1表现出更高的基础活性和最大的NO刺激活性，而α2/β1的NO敏感性则更高。嵌合体分析表明，NO依赖性激活的调控并非源自某个单一的α亚基元件，而是多个结构域协同作用的结果。综合来看，我们的发现支持这样一种功能概念：α2/β1作为一种高灵敏度的检测器，适用于检测弱信号或空间上受限的NO信号；而α1/β1则是一种灵敏度较低但信号放大能力更强的检测器，能够在较高NO浓度下产生强烈的cGMP响应。CRediT作者贡献说明Svenja Stomberg：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，可视化，验证，项目管理，方法学，研究实施，正式分析，数据整理，概念构思。S?nke Behrends：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，监督，资源提供，项目管理，概念构思。Svenja Stomberg|S?nke Behrends德国布伦瑞克工业大学药理学、毒理学与临床药学系