12(S)-HETE通过两种不同受体TXA2R和BLT2调节心肌细胞中IL-6和IL-10的表达

《Biochemistry and Biophysics Reports》：12(S)-HETE regulates the expression of IL-6 and IL-10 in cardiomyocytes through two distinct receptors, TXA2R and BLT2

　　

心脏炎症促进心力衰竭（HF）的发生和发展。尽管细胞因子是心脏炎症的关键介质，但脂质衍生代谢物也发挥重要作用；然而，其潜在机制仍很大程度上未被探索。在这些代谢物中，主要由15-脂氧合酶（ALOX15）产生的花生四烯酸衍生代谢物12?S-羟基-5Z,8Z,10E,14Z-二十碳四烯酸（12(S)-HETE）在心脏中的功能尚未完全阐明。在新生大鼠心肌细胞中，12(S)-HETE显著上调白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-10（IL-10）的表达。12(S)-HETE诱导的IL-6上调被血栓素A₂受体（TXA₂R）拮抗剂抑制，而单独使用TXA₂R激动剂可增加IL-6表达，提示TXA₂R信号参与其中。相反，药理学激活白三烯B₄受体2（BLT2）减弱了12(S)-HETE诱导的IL-6上调。单独使用BLT2激动剂不影响IL-6表达，但显著增加IL-10表达。此外，12(S)-HETE和BLT2激动剂均激活细胞外信号调节激酶（ERK）；这种激活被BLT2拮抗剂抑制，但不受TXA₂R拮抗剂影响。在心肌梗死（MI）小鼠模型中，血清中12-HETE（12(S)-HETE和12(R)-HETE的总量）水平和心脏ALOX15表达均升高。总体而言，这些发现将12(S)-HETE鉴定为MI后的一种可诱导脂质介质，通过协同激活TXA₂R和BLT2信号通路，调节心肌细胞中促炎和抗炎细胞因子的表达。因此，靶向12(S)-HETE信号可能代表一种预防炎症相关心脏重塑和HF的潜在治疗策略。

**论文解读：12(S)-HETE通过TXA₂R和BLT2受体调控心肌细胞炎症反应的新机制**

**研究背景与问题**
心脏炎症是心力衰竭（HF）发生和发展的关键驱动因素。尽管细胞因子（如IL-6、TNF-α）被认为是心脏炎症的核心介质，但脂质代谢物在其中的作用日益受到关注。然而，脂质介质调控心脏炎症的分子机制尚未完全阐明。12(S)-羟基二十碳四烯酸（12(S)-HETE）是花生四烯酸经15-脂氧合酶（ALOX15）催化生成的主要代谢物，已知参与血小板聚集、炎症和肿瘤增殖等过程。在非心脏细胞中，12(S)-HETE的潜在受体包括血栓素A₂受体（TXA₂R）、白三烯B₄受体2（BLT2）和G蛋白偶联受体31（GPR31）。根据人类蛋白质图谱数据库，心肌细胞表达TXA₂R和BLT2，但不表达GPR31，提示TXA₂R和BLT2可能是心脏中12(S)-HETE的功能性受体。然而，12(S)-HETE及其受体在心脏生理和炎症中的作用尚不清楚。本研究旨在探讨12(S)-HETE在心脏炎症中的功能，并阐明其受体机制。

**研究方法与结论**
研究人员利用新生大鼠心肌细胞（NRCMs）和心肌梗死（MI）小鼠模型，通过定量实时PCR（qRT-PCR）、ELISA、免疫印迹、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）脂质组学分析及免疫组化等技术，系统研究了12(S)-HETE对心肌细胞炎症因子表达的影响及其受体信号通路。主要结论如下：
1. 12(S)-HETE在心肌细胞中显著上调IL-6和IL-10的表达，而对TNF-α的诱导作用较弱，对IL-1β无显著影响。
2. 12(S)-HETE通过TXA₂R介导IL-6的上调，而BLT2的激活则抑制IL-6并促进IL-10表达，提示BLT2发挥抗炎作用。
3. 12(S)-HETE通过BLT2而非TXA₂R激活细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路，而Akt和STAT3未被激活。
4. 在MI小鼠模型中，血清12-HETE（12(S)-HETE和12(R)-HETE的总量）水平显著升高，心脏ALOX15表达上调，且ALOX15主要定位于梗死/边界区的心肌肌钙蛋白I阳性心肌细胞中。
该研究首次揭示了12(S)-HETE通过TXA₂R和BLT2两种受体协调调控心肌细胞中促炎和抗炎细胞因子表达的机制，为理解心脏炎症的脂质介质调控提供了新视角，并提示靶向12(S)-HETE信号通路可能成为预防炎症相关心脏重塑和HF的潜在治疗策略。论文发表在《Biochemistry and Biophysics Reports》。

**主要技术方法**
本研究采用的主要关键技术方法包括：
- 定量实时PCR（qRT-PCR）：用于检测细胞因子mRNA表达水平。
- 酶联免疫吸附试验（ELISA）：用于定量培养上清中IL-6蛋白水平。
- 免疫印迹分析：用于检测IL-10蛋白表达及ERK磷酸化水平。
- 液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）脂质组学分析：用于检测小鼠血清中脂质介质水平，样本来自非MI小鼠和MI后14天的小鼠（C57BL/6J小鼠，由日本SLC提供）。
- 免疫组化：用于观察心脏组织中ALOX15的定位。
- 细胞活力检测：使用CellTiter-Blue试剂盒评估心肌细胞存活率。

**研究结果**
**3.1 12(S)-HETE上调心肌细胞中IL-6和IL-10的表达**
通过qRT-PCR和ELISA，研究人员发现100 nM和1000 nM 12(S)-HETE处理NRCMs 1小时后，Il-6 mRNA显著上调，且培养上清中IL-6蛋白水平升高；TNF-α mRNA轻度升高，而IL-1β无显著变化。同时，1000 nM 12(S)-HETE显著上调Il-10 mRNA，免疫印迹证实IL-10蛋白表达增加，而TGF-β1无变化。表明12(S)-HETE主要诱导IL-6和IL-10表达。

**3.2 12(S)-HETE诱导的IL-6和IL-10表达由TXA₂R和BLT2介导**
通过受体拮抗剂和激动剂实验，发现TXA₂R拮抗剂SQ29548抑制12(S)-HETE诱导的IL-6上调，而TXA₂R激动剂U46619单独增加IL-6表达，但不影响IL-10。BLT2激动剂CAY10583抑制12(S)-HETE诱导的IL-6上调，并单独显著增加IL-10表达。BLT2抑制剂LY255283反而增强12(S)-HETE诱导的IL-10产生，而TXA₂R拮抗剂则倾向于降低IL-10表达，提示IL-10调控涉及受体交叉对话。

**3.3 12(S)-HETE通过BLT2激活ERK信号**
免疫印迹显示，12(S)-HETE和BLT2激动剂CAY10583均诱导ERK磷酸化，该磷酸化被BLT2拮抗剂LY255283抑制，但不受TXA₂R拮抗剂SQ29548影响。Akt和STAT3磷酸化未受影响，表明BLT2下游特异性激活ERK通路。

**3.4 MI增加血清12-HETE水平和心脏ALOX15表达**
LC-MS/MS脂质组学分析显示，MI后14天小鼠血清中12-HETE水平显著升高（倍数变化>2）。qRT-PCR显示心脏ALOX15 mRNA在MI后1-14天上调。免疫组化证实ALOX15主要定位于梗死/边界区的心肌细胞中，而非巨噬细胞、肌成纤维细胞或内皮细胞。

**总结与讨论**
本研究首次证明12(S)-HETE直接调控心肌细胞中炎症细胞因子的表达，并鉴定TXA₂R和BLT2为关键受体。12(S)-HETE通过TXA₂R促进促炎因子IL-6表达，同时通过BLT2激活ERK信号并诱导抗炎因子IL-10表达，揭示了一种复杂的受体网络调控机制。研究局限性包括：未探讨12(S)-HETE是否作为TXA₂R的偏向性激动剂；BLT2下游信号及IL-6、IL-10与ERK激活的因果关系需进一步阐明；体内研究仍需评估BLT2激活对心脏炎症的影响。
**研究结论**：研究人员鉴定出12(S)-HETE通过TXA₂R和BLT2信号在心脏炎症调控中发挥新作用。这些发现强调了12(S)-HETE依赖性通路作为预防炎症驱动的心脏重塑和HF的潜在治疗靶点。