关于硝氮苯类——苯并咪唑类阿片类药物（布托硝氮苯、乙托硝氮苯、异托硝氮苯、甲托硝氮苯和丙托硝氮苯）的首份全面毒性评估报告：运用计算机模拟方法预测对临床和法医学具有重要意义的关键毒理学参数

《Chemico-Biological Interactions》：The first comprehensive toxicity profile of nitazenes – benzimidazole opioids (butonitazene, etonitazene, isotonitazene, metonitazene and protonitazene): application of in silico methodology for the prediction of key toxicological parameters important from clinical and forensic point of view

　　摘要：尼塔泽类化合物属于2-苄基苯并咪唑类超强效合成阿片剂，尽管因具有致命的呼吸抑制作用及极高的滥用风险而在20世纪50年代被弃用，但如今又重新出现在非法药物市场中。由于其与传统阿片剂（如吗啡、芬太尼）在结构上的差异、效力难以预测，以及在尸检和临床毒理学案例中的检出率不断上升，因此亟需快速且经济高效的毒理学分析方法，以便用于中毒的临床处理以及涉及未知阿片剂的死亡案例的法医鉴定。本研究首次运用多种预测模型，包括Deep-PK、STopTox、AdmetSAR 3.0、ProTox 3.0、VEGA QSAR和Percepta 2023.1.2，对五种具有代表性的尼塔泽类化合物——丁氮嗪、乙氮嗪、异氮嗪、甲氮嗪和丙氮嗪进行了深入的计算机模拟毒理学研究。所有化合物都被预测具有较高的急性口服毒性，其LD50值在700–960毫克/千克（小鼠口服；ProTox 3.0和Percepta检测）之间，而腹腔注射时的数值则低至13–14毫克/千克（小鼠；Percepta检测）。N,N-二乙基乙二胺和硝基等毒效团被一致认为是导致全身性毒性的因素。健康影响预测显示，这些化合物很可能会引发多器官毒性，尤其是肺部（概率高达98%）、胃肠道（概率高达96%）以及心血管系统（概率高达94%）。遗传毒性预测结果则存在较大差异：TEST 5.1.2以较高置信度将这五种尼塔泽类化合物归为具有遗传毒性（可靠性指数高达1.0），而AdmetSAR 3.0等工具则认为它们不具有遗传毒性（概率低于50%）。此外，刺激潜力检测结果也并不一致，STopTox预测其可能引发眼睛刺激（置信度高达56%），而Percepta则认为其可能仅造成轻度皮肤刺激（概率仅为0.65）。这些研究结果对于临床毒理学、法医调查以及公共卫生监测具有重要意义，因为尼塔泽类化合物在过量用药案例中越来越常见，且往往无法通过常规检测方法被发现。同时，所识别的毒效团及预测出的器官毒性也为未来的代谢研究及靶向生物标志物的开发提供了依据。

引言：尼塔泽类化合物属于2-苄基苯并咪唑类的合成阿片剂，最初于20世纪50年代在药物研究中被作为潜在的镇痛药进行合成（Ujváry等人，2021年）。研发这类化合物的目的是为了创造高效镇痛剂，作为吗啡及其他阿片剂的替代品，因为后者虽应用广泛，但存在严重的副作用（Hataoka等人，2025年）。尽管尼塔泽类化合物具有出色的镇痛效果，但由于其极高的滥用可能性、严重的副作用（尤其是呼吸抑制），以及 safer替代品的出现，它们并未进入合法药品市场（Pergolizzi Jr等人，2023年）。然而近年来，尼塔泽类化合物又以新型精神活性物质的形式出现，给公共卫生和法医毒理学带来了巨大挑战（Vandeputte等人，2021年）。由于其高效力、结构多样性以及在毒理学案例中的检出率不断增加，尼塔泽类化合物在国际毒品监测体系中受到了特别关注。鉴于其独特的药理特性以及与芬太尼、吗啡等传统阿片剂不同的化学结构，联合国毒品和犯罪问题办公室将其单独归类在更广泛的新型精神活性物质分类体系中——见图1A。尼塔泽类化合物的化学结构以2-苄基苯并咪唑为核心结构——见图1B，这一结构与吗啡（菲衍生物）和芬太尼（苯胺哌啶衍生物）等传统阿片剂的结构截然不同（Vandeputte等人，2024年）。这种由含氮芳香环融合而成的核心结构赋予了这些化合物独特的药理和毒理特性。鉴于其极高的效力以及与传统阿片剂在结构上的显著差异，尼塔泽类化合物需要精确的毒理学表征，尤其是在其法医应用日益增多以及中毒临床处理方面（Walton等人，2022年；Montanari等人，2022年；Pardi等人，2023年）。本研究选择丁氮嗪、乙氮嗪、异氮嗪、甲氮嗪和丙氮嗪作为研究对象，是因为它们在法医案例中经常被检测到，近年来在非法药物市场中作为尼塔泽类化合物的代表而日益突出，而且它们的结构多样性有助于探究化学结构变化与毒理效应之间的关系。本研究所研究的五种主要尼塔泽类化合物因其侧链的不同而具有差异，而这些侧链会显著影响它们的效力、毒代动力学特征及毒理特性（Vandeputte等人，2024年）。例如，乙氮嗪因含有乙氧基侧链而具有极强的效力，而异氮嗪则因含有异丙基侧链而成为已知效力最强的尼塔泽类化合物之一（Vandeputte等人，2024年）。尼塔泽类化合物主要作为μ-阿片受体激动剂，能够与中枢神经系统中的这些受体结合并激活它们，从而产生强烈的镇痛效果及欣快感。它们对μ-阿片受体的亲和力极高，结合亲和力处于亚纳摩尔级别，因此属于已知效力最强的阿片剂之一（Kozell等人，2024年）。相比而言，它们的效力甚至超过了吗啡等传统阿片剂，也高于芬太尼等高效力合成阿片剂，这就导致了严重的健康风险，其中包括呼吸抑制，这也是尼塔泽类化合物所致死亡过量案例的主要原因（Vandeputte等人，2022年）。从药代动力学角度来看，尼塔泽类化合物具有快速吸收、高生物利用度以及在体内广泛分布的特点，这与它们的脂溶性有关。它们主要在肝脏中通过N-去烷基化和羟基化等代谢途径进行代谢，具体产生的代谢物因化合物种类而异（Huang等人，2024年）。例如，异氮嗪代谢后会生成N-去乙基异氮嗪，这种代谢物可在生物样本中被检测到（Walton等人，2023年）。近期研究显示，尼塔泽类化合物会发生大量代谢，并产生了多种可作为生物样本分析生物标志物的代谢物（Taoussi等人，2024年）。由于母体化合物的浓度可能较低或会迅速发生生物转化，因此基于代谢物的分析方法在法医鉴定和临床毒理学研究中越来越重要。因此，在对尼塔泽类化合物进行毒理学表征时，应同时考虑寻找和验证代谢物标志物。这些代谢特征对于理解其在法医毒理学中的检测情况至关重要。尼塔泽类化合物作为新型精神活性物质的出现始于2019年左右，异氮嗪是最早在非法药物市场被发现的同类化合物之一。全球各地的法医毒理学实验室报告称，在尸检案例、急诊就诊病例以及查获的毒品中，尼塔泽类化合物的检出率不断上升（Vandeputte等人，2021年）。在许多情况下，尼塔泽类化合物会与其他高效力阿片剂如芬太尼一同被检测到，从而加剧了过量用药的严重程度（Pardi等人，2023年）。由于这类化合物作为新型精神活性物质的迅速蔓延，多个国家采取了紧急管制措施，美国就将异氮嗪列入《控制物质法》的第一类管制物质中（Palkovic等人，2022年）。鉴于尼塔泽类化合物的高效力和严重毒性，有必要找到有效的方法来评估其毒理特性。需要指出的是，传统的体外和体内毒理学研究耗时较长、伦理考量复杂且成本高昂。在现代毒理学中，传统检测方法的局限性促使人们提出了新的研究理念，即转向以机制为基础、更贴近人类实际情况的研究方法，优先采用计算机模拟方法作为毒理学评估的起点。这一理念与Leist教授和Hartung教授提出的毒理学“新愿景”相契合，该愿景主张采用自下而上的策略：首先通过计算机模拟（以及体外实验）分析来绘制毒性路径，只有在仍存在关键缺失的情况下才进行动物实验（Leist等人，2008年）。计算机模拟研究利用计算方法预测毒性特征、识别潜在的分子靶标，并评估不良后果的发生可能性，从而能够在减少动物实验需求的同时实现早期危害识别。在此背景下，计算机模拟方法已成为重要的工具，能够快速、经济且符合伦理要求地预测新物质的关键毒理指标，如急性毒性、遗传毒性、眼部和皮肤刺激反应、心脏毒性以及器官特异性毒性等。这类评估可以是定性的，即估算毒性发生的可能性；也可以是定量的，即确定具体的毒理数值，如半数致死剂量（以毫克/千克体重计）或其他与剂量相关的参数。这种双重预测能力从根本上改变了现代毒理学筛查的方式，不仅在时间效率、成本降低以及伦理接受度方面具有显著优势，同时也有力支持了“3R原则”（替代、减少和优化动物实验使用）。此外，计算机模拟方法还被视为“绿色毒理学”方法，通过减少化学品使用、消除有害实验室废物以及尽量减少对动物资源的依赖（即减少试剂使用、无需活体实验、降低碳足迹），为可持续发展做出贡献。除了实际优势之外，计算机模拟方法还契合毒理学领域正在形成的更广泛的范式转变，即所谓的新方法学。新方法学代表了一种不断发展的科学理念，注重基于机制、贴近人类需求且不依赖动物实验的测试策略。它整合了计算毒理学、高通量体外筛选以及系统生物学方法，通常在不良后果路径框架内预测不良后果。在这种现代理念下，新方法学不仅能够加速化学物质的安全性评估，还能通过数据驱动、可持续且人道的科学方式，应对监管、环境及伦理方面的挑战。尼塔泽类化合物的迅速出现给临床毒理学家、法医实验室、中毒控制中心以及公共卫生机构带来了巨大挑战。许多尼塔泽类化合物的效力远高于芬太尼，可能作为海洛因、假冒药品或其他非法药物的掺假成分出现，还常常出现在多种药物混合使用的过量用药案例中（Vandeputte和Stove，2025年）。它们的结构多样性以及不断涌现的新类似物使得分析检测和毒理解读变得十分复杂。因此，提前预测其毒性特征并识别出潜在的危险结构元素，有助于确定分析检测的重点、优化毒理筛查策略，并在获得大量临床或流行病学数据之前就开展风险评估。因此，本研究首次对尼塔泽类化合物——即高效力、源自苯并咪唑结构的合成阿片剂，包括丁氮嗪、乙氮嗪、异氮嗪、甲氮嗪和丙氮嗪——进行了全面的毒理学分析。通过运用多种计算机模拟方法，本研究旨在预测关键的毒理参数，如急性毒性、器官毒性、皮肤和眼睛刺激反应以及遗传毒性。本研究的概念和方法流程如图2所示。通过首次为尼塔泽类化合物提供全面的计算机模拟预测结果，这些参数此前尚未通过传统方法得到测定，这项工作为主动评估合成阿片剂带来了重大进展。它为早期风险识别、法医鉴定以及针对这类新兴苯并咪唑阿片剂所致的中毒或药物滥用案例的循证临床决策提供了重要的参考依据。

片段摘录：
Deep-PK：Deep-PK是一个开放获取的、基于人工智能的平台（网址：https://biosig.lab.uq.edu.au/deeppk/），专门用于预测、分析和优化小分子的药代动力学及毒性特征。该平台利用图神经网络和基于图的特征来提高各种终点预测的准确性，可覆盖73种不同的参数，其中包括64种与ADMET相关的参数（吸收、分布、代谢、排泄等）。

急性毒性的定性预测：急性毒性的定性评估是对化合物在通过某种给药途径进入生物体后可能造成的危害进行初步筛选。它不仅包括概率预测，还包括通过不同强度的红色阴影来标示分子中易产生毒性的区域，这些区域被称为毒效团。毒效团指的是特定的功能团、结构特征或分子片段。

结论：本研究运用多种先进的计算机模拟方法，对五种新型设计的尼塔泽类化合物——丁氮嗪、乙氮嗪、异氮嗪、甲氮嗪和丙氮嗪——的毒性进行了全面评估。研究结果表明，这类化合物具有复杂的毒理特征，表现为一致的急性毒性、明显的多器官毒性以及严重的健康风险，而这些都与它们的化学结构密切相关。急性毒性预测结果显示……

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

CRediT作者贡献说明：?ukasz Ni?nik：撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、正式分析、数据整理。卡米尔·尤罗夫斯基：写作——审阅与编辑、写作——初稿撰写、可视化、验证、监督、软件使用、资源管理、项目管理、方法论、研究设计、资金筹集、正式分析、数据整理、概念构建。伦理审批：该手稿不包含新开展的临床研究或患者数据。数据可用性：本研究期间生成或分析的所有数据均包含在本文中。资金支持：本研究未获得公共部门、商业机构或非营利组织提供的任何资助。利益冲突声明：? 作者声明不存在可能影响本文所述工作的已知财务利益或个人关系。致谢：作者感谢米里亚娜·迪·斯特凡诺以及比萨大学药学系的蒂齐亚诺·图奇纳尔迪教授，感谢他们使用VenomPred 2.0软件帮助进行毒物结构可视化。卢卡什·尼日尼克|卡米尔·尤罗夫斯基，波兰罗兹市亚历山德罗夫斯卡街67/93号，91-205罗兹，罗兹医学专家研究所监管与法医毒理学系。