《Technology in Horticulture》：A simplified and efficient protocol for hairy root transformation of Glycyrrhiza uralensis
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致编辑：甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）是一种原产于中国且具有经济和药用价值的内生草本植物，其根和根茎中合成丰富的生物活性化合物，包括甘草酸（glycyrrhizic acid），这些化合物具有广泛的应用前景[1]。由于过度开发
致编辑：甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）是一种原产于中国且具有经济和药用价值的内生草本植物，其根和根茎中合成丰富的生物活性化合物，包括甘草酸（glycyrrhizic acid），这些化合物具有广泛的应用前景[1]。由于过度开发，加之该物种固有的生长缓慢特性，野生甘草种群已遭受严重萎缩。此类困境需要生物技术策略来保护野生种质资源并实现可持续利用[2]。目前的研究主要集中于解析其耐旱耐盐、深根特性以及胁迫诱导的黄酮类（flavonoids）和三萜类（triterpenoids）生物合成的分子适应机制[3,4]。发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）介导的发根转化是甘草基因功能鉴定和遗传改良的关键工具[5]。然而，大多数现有方案依赖于复杂的体外无菌组织培养，这种方法费力、易污染且转化效率低，缺乏快速可视化的转化验证[6]。同时，通过土壤扦插进行的常规营养繁殖在甘草中表现出生根缓慢和存活率不稳定的问题，限制了高效的遗传转化[7]。与其他药用豆科植物的已报道转化系统相比，甘草现有的发根转化方案通常存在几个局限性：严格依赖无菌操作、缺乏可视化筛选标记以及与基因编辑工具不兼容。为克服这些瓶颈，本研究首先为甘草建立了一种半湿扦插繁殖体系。与传统繁殖和发根转化策略不同，该体系消除了对无菌培养的严格需求。该方案消除了土壤基质和严格的无菌操作，具有操作简单和快速生根的特点。本实验设置三个生物学重复，共使用105个甘草茎段。采用本研究开发的半湿扦插法培养15天后，84个茎段诱导出不定根，生根率为80%（图1b）。在此基础上，进一步采用茎段作为外植体。研究人员在非无菌条件下使用发根农杆菌感染伤口表面，以诱导表达RUBY报告基因的发根。因此，建立了简单高效的甘草发根转化系统，实现了直接遗传转化（图1b），促进了该药用物种未来的生物技术研究。本研究使用了携带35S:RUBY可视化报告基因的表达载体（图1a）。采用已验证可在多种植物中进行遗传转化的发根农杆菌菌株Ar.1193进行感染。从第一到第三节间（直径2–2.5?mm）切取茎段（长度5–8?cm），保留1–2片叶和腋芽。顶端水平切割，基部伤口面做45°斜切。通过伤口蘸浸法进行接种。接种后的茎段置于铺有湿润滤纸的培养皿中，基部覆盖以保持湿度。茎段在26°C、16小时光照/8小时黑暗光周期下培养（图1b）。培养后14天出现红色假定转基因发根，20天时生长旺盛，形态上与未接种对照组产生的白色不定根明显不同。正常生长的红色根被视为假定转基因发根（图1d）。总共90个甘草茎段经发根农杆菌伤口蘸浸接种。培养后，59个茎段基部成功分化出红色转基因发根（图1f）。随机选取30个独立的红色发根系进行PCR检测。所有测试样本中均扩增出rolB基因片段，证实与35S:RUBY构建体成功共转化。同时，在任何根样本中均未检测到virG扩增子，排除了残留发根农杆菌污染。该结果证实发根农杆菌能有效从甘草茎段诱导发根，总体转化效率为65%。生根的茎段在营养液中适应1周后移栽到盆中用于后续功能试验。同时，本研究整合了苜蓿（Medicago sativa）[8]的发根农杆菌介导的发根转化系统与35S:RUBY载体。以甘草的下胚轴为外植体，按照苜蓿感染程序进行转化（图1c）。同时，为评估下胚轴蘸浸接种的转化效率，研究人员量化了产生红色转基因发根的外植体数量。在120个经农杆菌蘸浸接种的下胚轴外植体中，57个外植体基部区域成功出现红色发根。这些结果表明该体系能稳定诱导甘草发根形成，并适用于甘草的遗传转化研究（图1f）。为进一步验证该体系进行靶向基因组编辑的能力，研究人员部署了CRISPR/Cas9来破坏SRT2基因（图1a）。该基因编码组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase, HDAC），负调控甘草查尔酮A（licochalcone A）和总黄酮积累，并通过抑制下游结构基因表达来抑制黄酮类生物合成[9]。对单个转基因发根的高通量测序揭示了SRT2靶位点处1–15?bp的插入缺失突变（indel mutations），以及单碱基插入和单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism, SNP）变异。突变精确定位于gRNA靶向序列和相邻的PAM（Protospacer Adjacent Motif）区域（图1g）。本研究共对10个独立的转基因发根系进行了测序。其中，两个系在SRT2靶位点含有纯合突变，其余八个系显示嵌合突变。嵌合系进一步分为两个亚组：四个系具有48.47%至52.54%的高编辑效率，另外四个系显示弱嵌合性，编辑效率相对较低，为15.92%–33.11%。这些结果验证了该平台可实现稳健且特异的靶向编辑活性。为评估该CRISPR/Cas9工具的编辑特异性，研究人员进一步基于序列同源性预测了甘草基因组中潜在的脱靶位点。对高风险脱靶位点的Sanger测序显示，在所有测试的发根系中均未发现错配突变，证实了该编辑系统的高靶向保真度。总之，研究人员的CRISPR/Cas9系统在甘草中实现了稳健的基因组编辑。随后，按照先前文献报道的标准方案，通过qRT-PCR定量检测了六个核心SRT2调控的下游基因（CYP8, NAC, CYP7, FLS, LMT, bHLH）的转录本丰度。与野生型发根相比，纯合SRT2编辑的阳性发根中这些下游基因显著上调，与SRT2的负调控作用一致（图1h）。这些发现证实，发根农杆菌介导的SRT2编辑有效缓解了下游黄酮类生物合成途径的转录抑制。基因编辑的生物学效应在转录水平上得到验证，为甘草的基因功能解析和代谢调控研究提供了强大工具。总之，本研究建立了一种简单高效的甘草半湿扦插技术，并在此基础上开发了非无菌、高效的发根转化系统。此外，将苜蓿的发根转化系统适用于甘草，实现了高效的CRISPR/Cas9介导的基因编辑。靶位点突变检测和SRT2六个关键下游基因的qRT-PCR验证在分子和转录水平上确认了编辑效果，凸显了该系统在甘草研究中的巨大应用潜力。尽管转基因在子代植物中的遗传稳定性仍有待表征，但该技术支持甘草的功能基因组研究。它适用于生物活性化合物（甘草酸、黄酮类）的途径解析、调控探索和质量改良。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）是一种原产于中国、兼具经济与药用价值的内生草本植物，其根和根茎中富含甘草酸（glycyrrhizic acid）和多种黄酮类（flavonoids）等生物活性化合物，应用前景广阔。然而，过度采挖导致野生资源急剧萎缩，加上该物种固有的缓慢生长特性，亟需生物技术手段保护种质并实现可持续利用。当前，发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）介导的发根转化是解析甘草耐旱、耐盐分子机制以及促进黄酮和三萜类（triterpenoids）生物合成研究的核心工具。但现有方案多依赖体外无菌组织培养，存在操作繁琐、易污染、转化效率低且缺乏可视化标记等缺陷；常规土壤扦插繁殖生根缓慢、成活率不稳定，进一步限制了遗传转化效率。针对上述瓶颈，研究人员开展本研究，旨在建立一种简化、高效且非无菌的甘草发根转化体系，并整合基因编辑工具，为甘草功能基因组学与代谢工程提供可靠平台。
**研究内容与结论**
本研究首先建立了一种半湿扦插繁殖体系，摒弃了传统无菌培养和土壤基质，通过简单操作实现快速生根（15天生根率达80%）。在此基础上，以茎段为外植体，利用携带35S:RUBY可视化报告基因的发根农杆菌菌株Ar.1193，在非无菌条件下通过伤口蘸浸法感染，成功诱导出红色荧光发根，转化效率达65%。同时，将苜蓿（Medicago sativa）的发根转化系统适配至甘草下胚轴，也实现了稳定转化。为验证该体系在基因编辑中的应用潜力，研究人员部署CRISPR/Cas9系统靶向敲除SRT2基因——该基因编码组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase, HDAC），负调控甘草查尔酮A（licochalcone A）和总黄酮积累。高通量测序显示，在10个独立转基因发根系中，2个系为纯合突变，其余为嵌合突变（编辑效率15.92%–52.54%），且脱靶分析证实了高靶向保真度。qRT-PCR分析进一步表明，纯合SRT2编辑系中六个下游核心基因（CYP8、NAC、CYP7、FLS、LMT、bHLH）显著上调，与SRT2的负调控作用一致，从转录水平验证了基因编辑的生物学效应。该研究发表于《Technology in Horticulture》，为甘草的基因功能解析和活性成分（甘草酸、黄酮类）代谢调控提供了高效、简便的技术平台。
**关键技术与方法**
1. **半湿扦插繁殖体系**：从甘草茎段（第一至第三节间，长5–8?cm，直径2–2.5?mm）制备插穗，保留1–2叶和腋芽，基部斜切后置于湿润滤纸培养皿中，26°C、16h光照/8h黑暗下培养15天，诱导不定根（生根率80%）。
2. **发根农杆菌介导转化**：使用携带35S:RUBY报告基因的表达载体，菌株Ar.1193通过伤口蘸浸法感染茎段基部或下胚轴，在非无菌条件下培养14–20天，通过红色荧光筛选阳性发根。
3. **CRISPR/Cas9基因编辑**：构建靶向SRT2基因的CRISPR/Cas9载体（含AtU6启动子驱动的sgRNA和35S驱动的Cas9），转化后通过高通量测序鉴定突变类型（纯合、嵌合、indel、SNP），并利用Sanger测序评估脱靶效应。
4. **qRT-PCR验证**：对六个SRT2调控的下游基因（CYP8、NAC、CYP7、FLS、LMT、bHLH）进行转录本定量分析，比较纯合编辑系与野生型发根的差异表达。
**研究结果**
**半湿扦插体系的建立**：通过105个茎段的三次生物学重复，15天后84个茎段生根，生根率80%，表明该方法简单快速且无需无菌条件。
**发根转化体系的建立与效率**：90个茎段经发根农杆菌蘸浸接种后，59个茎段基部产生红色发根，转化效率65%；120个下胚轴外植体中有57个产生红色发根。PCR检测在所有阳性根中扩增出rolB基因，且无virG污染，证实成功转化。
**CRISPR/Cas9基因编辑验证**：对10个独立转基因发根系进行靶位点测序，发现1–15?bp的插入缺失突变及单碱基插入/SNP。2个系为纯合突变，8个系为嵌合突变（其中4个高效率48.47%–52.54%，4个弱嵌合15.92%–33.11%）。脱靶预测和Sanger测序未检出高风险位点突变，证实编辑特异性。
**转录水平生物学效应**：qRT-PCR显示，纯合SRT2编辑系中六个下游基因表达量显著高于野生型对照，符合SRT2的负调控功能，表明基因编辑有效解除了对黄酮类生物合成途径的转录抑制。
**讨论与结论**
本研究成功建立了甘草的半湿扦插繁殖体系，并在此基础上开发了非无菌、高转化效率的发根转化系统，同时适配了苜蓿转化体系实现CRISPR/Cas9基因编辑。SRT2靶位点突变检测和下游基因表达验证从分子与转录水平证实了编辑效果，系统具有高靶向保真度。尽管转基因在子代中的遗传稳定性尚待表征，但该技术弥补了传统方法依赖无菌操作、缺乏可视化标记等不足，为甘草的基因功能研究、代谢途径解析及活性成分（甘草酸、黄酮类）质量改良提供了简便、高效的工具。研究结论：该半湿扦插结合发根农杆菌转化与CRISPR/Cas9基因编辑的平台，适用于甘草功能基因组学与生物技术应用。
