《The Crop Journal》：GDSL WILTING LEAF1 protein confers heat, drought, and salt stress tolerance in maize by regulating vascular development
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作物产量受高温和干旱等非生物胁迫的限制。在本研究中，研究人员表征了一个萎蔫玉米突变体wilting leaf1（wl1-ref），其表现出叶片萎蔫、矮化和产量受损。萎蔫表型在高温、干旱和盐等多种非生物胁迫下加剧。wl1-ref突变体在维管束发育上存在明显缺陷，
作物产量受高温和干旱等非生物胁迫的限制。在本研究中，研究人员表征了一个萎蔫玉米突变体wilting leaf1（wl1-ref），其表现出叶片萎蔫、矮化和产量受损。萎蔫表型在高温、干旱和盐等多种非生物胁迫下加剧。wl1-ref突变体在维管束发育上存在明显缺陷，原生木质部导管异常或缺失，导致水分转运受损。WL1编码一个定位于内质网和细胞质的GDSL蛋白，在根、茎和叶鞘等富维管组织中高表达。转录组分析显示与胁迫响应及细胞壁生物合成和修饰相关的通路发生显著变化，这导致了木质素减少和细胞壁维管结构破坏。综上所述，研究人员的结果表明WL1通过影响细胞壁完整性和维管发育促进玉米水分转运和非生物胁迫耐受性，凸显了其作为培育抗逆玉米品种靶点的潜力。
该研究围绕玉米在气候变化背景下遭受高温、干旱及盐碱等非生物胁迫导致产量损失的问题展开。目前，关于叶片萎蔫与水分吸收、转运及气孔调节的关系已有一定认识，维管系统在水分传导中的核心作用也被指出，但特定基因尤其是GDSL蛋白家族成员在玉米维管发育与非生物抗性中的具体功能仍大多未被探索。鉴于此，研究人员通过开展对玉米萎蔫突变体wl1-ref的表征与机制解析，旨在明确关键基因WL1的功能，阐明其通过维管发育调控水分转运及胁迫耐受性的分子基础，为抗逆育种提供靶点。该研究发表于《The Crop Journal》。
为开展研究，研究人员主要利用了以下关键技术方法：植物材料方面，使用自交系KN5585中发现的wl1-ref天然突变体，将其回交至B73背景三代，并从中国玉米EMS诱导突变数据库获取wl1-ems1和wl1-ems2等位突变，利用CRISPR/Cas9系统在KN5585背景下构建wl1-cr1和wl1-cr2突变体；通过生理性状测量评估叶绿素、类胡萝卜素、丙二醛（MDA）含量、叶片失水率及水分转运效率；利用组织切片与显微镜技术（光学显微镜、扫描电镜SEM、透射电镜TEM）观察维管束密度与细胞壁超微结构；采用BSR-seq（Bulked Segregant RNA Sequencing）与KASP标记进行基因定位与克隆；通过RT-qPCR、RNA原位杂交分析基因表达模式；利用亚细胞定位融合载体转化玉米原生质体观察蛋白定位；进行转录组RNA-seq分析差异表达基因（DEG）并进行GO富集分析；测定纤维素、半纤维素和木质素等细胞壁组分含量。
3.1. The wl1 mutant exhibits wilting leaf and dwarf phenotype
研究人员在正常条件下观察到wl1-ref突变体在营养生长阶段即出现早期萎蔫症状，生殖阶段成熟叶片尖端与边缘萎蔫明显，叶绿素与类胡萝卜素水平显著降低，株高降低约48.7%，矮化源于节间缩短而非节间数减少，且雄穗发育严重受损无法散粉，茎秆脆而易折。这些结果表明WL1在玉米生长发育中起关键作用。
3.2. Vascular defects lead to impaired water translocation in wl1-ref mutant
研究人员测定叶片相对含水量（RWC）与失水率，发现突变体RWC自叶基向叶尖递减且在叶尖更低，失水率略高但不显著，气孔密度形态与根系构型无显著差异。染料转运实验显示突变体茎中染料上升明显减弱，组织切片显示维管束数量显著减少但密度增加，维管束形态分类中正常束比例大幅下降且缺陷束增加，叶鞘亦见类似异常，后生木质部导管具缘纹孔变小。证实wl1-ref因维管发育异常导致水分转运受损进而引起萎蔫。
3.3. The wl1 mutant is sensitive to abiotic stresses
研究人员在V3期对WT与wl1-ref进行40℃高温、干旱及200 mmol L?1 NaCl盐胁迫处理，突变体在40℃处理24小时后剧烈萎蔫，72小时后存活率约28.3%远低于WT的85%，35℃即开始出现叶尖萎蔫；干旱与盐胁迫下萎蔫加剧且存活率大幅降低；胁迫后MDA含量显著升高。WL1在各胁迫下表达量呈先升后降动态变化，表明WL1参与响应高温、干旱和盐胁迫。
3.4. Positional cloning of wl1
研究人员利用F2群体分离比确认萎蔫为单隐性等位基因控制，通过BSR-seq将位点初定在染色体6长臂42.1 Mb区域，利用4023个F2:3个体与KASP标记精细定位至KM8与KM10间400 kb区域，该区域含7个注释基因。重测序发现wl1-ref在Zm00001d037556起始密码子下游391 bp处有一个4166 bp的Ac/Ds型转座子插入，导致转录提前终止；wl1-ems1与wl1-ems2在保守GDSL域有点突变；CRISPR/Cas9敲除株wl1-cr1与wl1-cr2表型复制了wl1-ref的萎蔫、矮化、维管缺陷与茎脆表型及胁迫敏感，确证Zm00001d037556为WL1基因座位。
3.5. WL1 encodes a GDSL protein that is preferentially expressed in vascular tissues
研究人员预测WL1编码含保守GXSXXXXG基序的GDSL蛋白，系统发育分析显示其与水稻OsGELP62、OsGELP60、OsGELP61、OsGELP14高度同源。亚细胞定位显示WL1-GFP与内质网（ER）标记mCherry-HDEL部分共定位于ER及细胞质。RT-qPCR与公共数据显示WL1在根、茎、叶鞘等富维管组织中表达较高，RNA原位杂交在28天苗根中柱与茎维管束检出强WL1 mRNA信号，表明WL1偏好表达于维管组织。
3.6. WL1 affects vascular development by affecting cell wall structure
研究人员对V3期幼苗叶片进行转录组分析，获1438个差异表达基因（DEG），GO富集突出水解酶活性、胁迫响应、次生代谢过程及细胞壁生物发生，其中苯丙烷代谢过程最显著，木聚糖葡聚糖酶（XTH1, XTH3, XTH4, XTH7, XTH27, XTH30）与纤维素合酶（CESA4, CESA7, SESA8, CESA9, CESA10）显著上调。测定细胞壁组分发现突变体木质素含量显著降低，纤维素与半纤维素显著升高。透射电镜（TEM）显示突变体维管束鞘细胞次生细胞壁（SCW）增厚且电子密度降低，与木质素沉积减少一致，表明WL1通过影响细胞壁组分与结构调控维管发育。
在讨论部分，研究人员指出全球玉米生产受高温干旱威胁，wl1-ref突变体在胁迫下萎蔫与生长抑制加剧且MDA升高，敏感性源于维管异常导致水分转运受损而非矮化本身，维管完整性对水分利用效率至关重要，表型与玉米nut1、ds1/Exo70A1突变体相似，提示WL1可能协同调控水分利用与抗逆。讨论进一步指出wl1-ref在正常条件下亦表现矮化与偶发萎蔫，但MDA仅在胁迫下升高且WL1表达受胁迫动态诱导，表明矮化与胁迫敏感是同一维管缺陷的并行表现。WL1参与次生细胞壁（SCW）生物合成与结构，转录组富集苯丙烷代谢，木质素降低致茎脆，纤维素半纤维素改变致SCW增厚与构造破坏。WL1属GDSL家族，具酯酶/脂酶或多糖脱乙酰酶活性，与水稻OsGELP62同源，推测WL1可能具阿拉伯糖脱乙酰酶活性参与细胞壁多糖修饰，具体酶活性需进一步研究。
研究结论为：WL1编码定位于内质网与细胞质的GDSL蛋白，在维管组织高表达；wl1突变导致维管束与原生木质部缺陷、木质素减少及细胞壁结构异常，损害水分转运并加剧对非生物胁迫的敏感；WL1通过影响细胞壁完整性与维管发育贡献于玉米水分转运与非生物胁迫耐受性，是培育抗逆玉米品种的潜在靶点。
