《Current Research in Neurobiology》：Fish gut-water interface as a hotspot for the dissemination of antibiotic resistance genes across natural and aquaculture systems
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淡水生态系统是抗生素抗性基因（ARG）的重要储库和传播途径，然而，宿主介导的微生物选择和人为压力对鱼类肠道抗性组的影响仍缺乏充分表征，尤其是在南亚主要河流系统中。研究人员对来自两个主要河流系统（亚穆纳河和印度河）和两个水产养殖场的六个地理上不同地点采集的194
淡水生态系统是抗生素抗性基因（ARG）的重要储库和传播途径，然而，宿主介导的微生物选择和人为压力对鱼类肠道抗性组的影响仍缺乏充分表征，尤其是在南亚主要河流系统中。研究人员对来自两个主要河流系统（亚穆纳河和印度河）和两个水产养殖场的六个地理上不同地点采集的194条鱼（代表四种物种）及其相关水体样本，进行了鸟枪法宏基因组学和基因组分辨分箱分析。鱼类肠道培育出与周围水体不同的微生物群落，揭示了宿主对环境微生物群的强烈过滤作用。在所有样本中，检测到1,108个ARG亚型，赋予对14种抗生素类别的耐药性，包括超广谱β-内酰胺酶（blaTEM, blaCTX-M）和世界卫生组织关键优先碳青霉烯酶（blaIMP, blaOXA）。来自印度河的鱼类维持了多样但相对稳定的抗性组，主要由内在染色体外排机制主导，而来自城市化亚穆纳河的鱼类，特别是Labeo boggut，表现出临床重要ARG的显著富集。移动遗传元件（MGEs）和毒力因子（VFs）的流行率在鱼类肠道微生物组中持续高于其周围水体，表明水平基因转移和微生物持久性的潜力增加。共获得19个携带多个ARG、VFs和质粒相关标记的宏基因组组装基因组（MAGs），识别出具有维持和传播抗菌素耐药性能力的细菌种群。这些结果证实，栖息在受人为影响的河流系统中的鱼类可作为临床相关耐药决定因子的重要储库，突显了通过水生生态系统进行环境传播、水产养殖和人类暴露的潜在风险。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
抗生素的发现是现代医学的重要里程碑，但抗生素的不合理使用导致抗生素抗性基因（ARGs）在全球范围内扩散。到2050年，由抗菌素耐药性（AMR）引起的感染每年可能导致约1000万人死亡，使AMR成为2024年全球十大健康威胁之一。“One Health”框架强调通过认识环境生态系统的相互依赖部分来对抗ARGs，旨在防止ARGs在动物-环境-人界面跨物种传播。未代谢的抗生素在水生生态系统中累积，产生选择压力，并通过水平基因转移（HGT）促进ARGs的传播。移动遗传元件（MGEs）显著增强HGT，毒力因子（VFs）则可能加剧耐药细菌的致病性。集约化水产养殖在鱼类肠道微生物组中维持ARG储库，甚至超出抗生素暴露范围，并富集临床重要的质粒介导耐药基因。
**为什么开展这项研究**
目前，全球淡水鱼肠道微生物组的大规模目录正在出现，但南亚河流系统中宿主介导的微生物选择和对鱼类肠道抗性组的人为压力仍缺乏充分表征。尽管已有研究记录了东南亚国家水产养殖、河水及沉积物中ARGs的存在与传播，但在南亚河流系统（如印度河和亚穆纳河）中，关于鱼类肠道作为AMR、移动组和VFs出现与传播热点的作用仍存在显著知识空白。此外，经济上重要的本地野生鱼类（如喜马拉雅雪鳟Schizothorax plagiostomus和亚穆纳河本地鱼Labeo boggut）在基因组分辨宏基因组数据库中尚未被代表。本研究旨在通过整合印度两条河流（相对原始的印度河和高污染亚穆纳河）以及两个水产养殖场的鱼类肠道和水体宏基因组，利用高分辨率鸟枪法宏基因组学和宏基因组组装基因组（MAGs），全面表征微生物群落，阐明ARGs、VFs和MGEs的特征与机制，并评估其在“One Health”框架下的生态与公共卫生意义。论文发表在《Current Research in Neurobiology》。
**主要关键技术与方法**
研究人员采用鸟枪法宏基因组测序（Illumina NovaSeq 6000平台，150 bp双端读长）对194个鱼肠道内容物（每个物种按采样点合并为6个复合样本）和4个水体样本（0.22 μm过滤）进行测序。使用Megahit进行de novo组装，Prodigal预测蛋白编码基因，DIAMOND分别比对NR数据库（分类学注释）、CARD数据库（ARGs鉴定）、VFDB核心数据库（VFs）和MGEs90数据库（MGEs），以90%一致性和1e
-10 E值筛选。利用MaxBin2、MetaBAT2和CONCOCT进行基因组分箱，Benette优化，CheckM2评估MAGs质量（完整度>50%，污染<10%）。GTDB-Tk进行分类学分类，ABRicate结合多个数据库（CARD、NCBI AMR、ARG-ANNOT、MEGARes 2.0）筛选MAGs中的ARGs，PLasmidFinder鉴定质粒复制子，Salmon计算TPM归一化丰度。样本来源：亚穆纳河（德里Sur ghat和Sonia vihar）采集Labeo boggut（LB，n=70）和Cyprinus carpio carpio（CR，n=25）；印度河（拉达克Shey和Nimmo）采集Schizothorax plagiostomus（SF，n=21；NF，n=33）；拉达克Chuchot和Kargil鱼场采集Oncorhynchus mykiss（CF，n=20；KF，n=25）。水体样本来自DSgW、DSvW、SW和CW。
**研究结果**
**3.1. Taxonomic composition patterns in the fish gut and its surrounding habitat**
通过NR数据库对10个宏基因组样本进行细菌、古菌和病毒群落分类分析，发现水生环境与鱼类肠道微生物组之间存在明显生物过渡，表明鱼类肠道是高度选择性的生态位，而非水体的简单反映。三大优势门为Pseudomonadota、Bacteroidota和Bacillota，占总分类微生物群落的90%以上，但其分布受宿主选择性过滤和局部环境变量调节。水体样本中Bacteroidota丰度高（DSvW达34.96%），指示污水和粪便污染；病毒门Uroviricota在LB样本中相对丰度较高（3.29%），提示噬菌体介导的捕食作用。
**3.2. Antibiotic resistance genes (ARGs) in the fish gut and its surrounding habitat**
基于CARD数据库分析，检测到1,108个ARG亚型，赋予对14种抗生素类别的耐药性。β-内酰胺耐药基因最丰富（837个亚型），其次是多药耐药（74个）、氟喹诺酮（69个）和氨基糖苷类（48个）。β-内酰胺相对丰度在CW（97.34%）最高，多药耐药在SW（95.42%）和CF（89.27%）占主导。LB样本中绝对ARG丰度最高，NF、SF和KF次之。PCoA分析显示，亚穆纳河样本形成中心组，与印度河鱼样本部分重叠，总方差40.3%，PERMANOVA R2=0.221（p=0.397），表明地理区位解释了22%以上的抗性组变异。在1,108个ARGs中，952个为获得性ARGs，156个为内在性ARGs。获得性ARGs中，ESBL基因blaTEM和blaCTX-M在亚穆纳河（CR和DSvW）和印度河鱼样品（NF和SF）中检出；碳青霉烯耐药基因blaIMP、blaOXA和blaGES在多个位点存在。多药耐药基因中，oqxA、oqxB、qacE等为获得性移动耐药决定因子，在亚穆纳河水体中较丰富。临床相关ARGs如emrB、mdtE、TolC等广泛分布；质粒介导的喹诺酮耐药基因qnrB、qnrS和QnrVC家族在两个河流系统中均有检出。亚穆纳河样本富集质粒和整合子关联的ARGs（如cmlA、tet(A/B/C/G)、sul1）。
**3.2.1. The abundance of ARGs in host bacteria**
Spearman等级相关分析发现，Abditibacteriota门与双环霉素类抗生素显著正相关；Pseudomonadota与β-内酰胺耐药基因正相关（FDR<0.05）。共现分析显示，Enterobacter cloacae在所有样本中均检测到，主要携带β-内酰胺和多药耐药基因；Escherichia coli携带广谱ARGs；临床相关病原菌如Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa、Enterococcus faecalis等与多个ARGs相关。
**3.3. Mobile Genetic Elements (MGEs) in the fish gut and its surrounding habitat**
MGE概况显示，噬菌体相关MGE（21.09-41.58%）和整合/切除（17.88-61.50%）是主要功能类别。鱼类肠道样本中MGE绝对丰度高于水体样本，LB样本最高，NF和SF次之。contig水平共现分析表明，鱼类肠道样本中ARGs与MGEs共定位比例更高。PCoA显示鱼类肠道样本在排序图中聚集，与水体样本分离，总方差65.8%，地理区位仅解释21.2%变异（p=0.487）。
**3.4. Virulence Factor (VF) in the fish gut and its surrounding habitat**
共鉴定125个独特的VFs元素，分为13个功能类别，表现出空间异质性。DSgW中粘连相关VFs占主导（46.40%），CR中运动相关VFs丰富（33.08%），CF中营养/代谢因子高度富集（89.21%），KF中免疫调节VFs最高（35.06%），SF中效应物递送系统占23.70%。PCoA解释总方差57.2%，PERMANOVA R2=0.203（p=0.526）。Spearman相关分析发现，Uroviricota门与抗菌活性/竞争优势、调节和效应物递送系统等功能强相关；Pseudomonadota与免疫调节正相关；Deinococcota与粘连和效应物递送系统负相关。在属水平，印度河样本中Escherichia、Enterobacter和Pseudomonas是主要VFs携带属；亚穆纳河样本中VFs分布更广。Pearson相关分析显示CR与DSvW（0.89）、SF与NF（0.97）的毒力组高度相似。在种水平，166个细菌物种与VFs相关，包括E. coli、Aeromonas allosaccharophila、Enterobacter cloacae等；机会致病菌如Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa等构成水生毒力组的重要组分。
**3.5. MAGs: ARG, VFs and MGEs carrying host**
通过宏基因组分箱恢复52个MAGs（完整度>50%，污染<10%），其中19个携带至少一个ARG、VF或质粒。18个MAGs携带ARGs（共147个，94个获得性，53个内在性），8个含VFs，4个含质粒。分类学上，MAGs分属Pseudomonadota、Bacillota和Bacteroidota三个门。63.16%的MAGs携带≥2个ARG亚型，42.11%携带≥3个，多数属于Gammaproteobacteria。关键MAGs：来自印度河雪鳟（SF）的E. coli（Bin_1083）携带32个ARGs、25个VFs和1个p0111_1质粒复制子，包含16个RND外排泵、7个MFS转运体及多种β-内酰胺酶；Klebsiella grimontii（bin_2251）含β-内酰胺酶和15个多药外排泵；Enterococcus hirae（bin_870）携带两个质粒复制组（repUS15_2和rep11a_1）和氨基糖苷耐药基因AAC(6′)-Iid；Citrobacter portucalensis（bin_993）含14个ARGs和粘连相关VFs。来自亚穆纳河Sur ghat水样（DSgW）的Aeromonas salmonicida（bin_4291）携带β-内酰胺酶（IMI-3）、氟喹诺酮（QnrVC1）、SMR外排泵及MLS耐药基因。来自LB的Aeromonas veronii_A（bin_33）含两个β-内酰胺耐药基因和肽类耐药基因。
**总结讨论与结论**
讨论部分指出，全球河流和水产养殖系统是临床相关耐药决定因子出现和传播的重要环境储库，亟需改善水质和卫生条件以限制AMR传播，符合联合国可持续发展目标6。本研究结果揭示了鱼类肠道-水界面作为ARGs、MGEs和VFs共现的热点，亚穆纳河样本（特别是LB）中获得性ARGs丰富，表明其作为环境储库的潜力；印度河样本中ARGs主要为内在性，但ESBL基因的检出说明即使在较少人为压力的生态系统中，AMR也能传播。MGEs和VFs在鱼类肠道微生物组中的富集，特别是Enterobacteriaceae和生物膜形成菌群，凸显了人畜共患风险和水生生态系统的公共卫生影响。MAGs中ARGs、质粒复制子和毒力决定因子的聚类，为风险评估提供了优先目标。缓解措施需要高分辨率基因组监测、靶向监测抗生素残留和共选择污染物，以及减少污水输入、营养负荷和不合理抗生素使用的管理干预，以限制水平基因转移。
**研究结论**：可移动ARGs、MGEs和VFs在河流和水产养殖系统中的共现，将这些环境确定为抗菌素耐药性传播的关键储库，强调需要在印度国家行动计划2.0下进行整合的“One Health”监测。结果指出，在亚穆纳河样本（特别是LB和水体）中，获得性ARGs的显著出现表明这些地点的微生物种群可能作为ARGs储库并潜在地在环境中传播，而印度河样本中大多数ARGs为内在性质。此外，样本中独特的MGEs和VFs，尤其是在NF、CR和SF鱼类中，识别了微生物微宇宙在水生生态系统健康中的作用，特别是在Enterobacteriaceae和生物膜形成菌群中。这凸显了这些水生生态系统带来的人畜共患风险和公共卫生关注。ARGs、质粒复制子和毒力决定因子在有限MAGs中的聚类，突出了风险评估的优先目标。缓解将需要高分辨率基因组监测、靶向监测抗生素残留和共选择污染物，以及减少污水输入、营养负荷和不合理抗生素使用的管理干预，以限制水平基因转移。
