综述：种子细菌微生物群：传播、群落组装及对作物可遗传功能工程化的展望

《Current Research in Microbial Sciences》：Seed bacterial microbiota: transmission, community assembly, and prospects for engineering heritable functions in crops

　　

摘要 种子代表了专门的、低生物量的微生物生态位，能够促进植物相关微生物群从一代向另一代的传递。种子相关细菌既可作为附生菌也可作为内生菌存在，在种子到幼苗的转变过程中促进微生物群落的组装。单粒种子组学与合成细菌群落的最新整合已使该领域超越了描述性调查，能够识别植物萌发轨迹和早期抗逆性的微生物驱动因素。尽管存在这种潜力，种子携带细菌的定殖和持久性常常受到土壤来源微生物群竞争的限制。幼苗细菌群落的组装进一步受宿主基因型、驯化历史和母体环境条件的塑造。本综述综合了从开花到幼苗出土期间细菌传播的机制，并评估了种子全生物体（holobiont）的功能能力。我们定义了将工程化的基于种子的菌群成功招募到土-植连续体中的生态学参数，提供了一条将基于种子的技术从实验室推向田间的实验路线图。确保这些可遗传微生物性状的功能稳定性是在日益加剧的气候波动下稳定农业生产力的先决条件。

1. 1.
   引言
   植物作为一个全生物体（holobiont）发挥作用，其性状由植物本身及定殖于根际、叶际和内圈等区室的微生物共同决定。这些微生物能够影响养分获取、胁迫耐受性和病原防御，从而在不同环境中促进植物表现。在广泛的植物微生物组中，种子构成了一个独特且仍未被充分探索的微生物栖息地，连接着植物的代际传递。种子微生物群包含细菌、真菌和古菌，可作为幼苗最早的微生物接种源，进而影响后续植物微生物群的组装。然而，关于种子相关微生物如何被获取、传递给下一代以及在种子接触土壤后如何发挥功能的机制性理解仍然有限。种子相关细菌定殖于种子表面（附生菌）和内部组织（内生菌），其中特定类群可通过垂直传播来自母体宿主。在多种作物中，Pantoea、Massilia、Pseudomonas和Sphingomonas等细菌类群常被检测到，表明其在种子携带的群落中具有广泛的宿主范围持久性。在植物功能相关性方面，部分种子相关细菌已被证明可通过植物激素信号传导、养分动员和病原体拮抗作用来调节萌发动态和早期幼苗活力。在萌发过程中，种子分泌物形成精子圈（spermosphere），促进微生物-微生物相互作用并介导幼苗的早期定殖。尽管种子微生物群可在种子出土期间限制病原体入侵，但这种保护效应的程度取决于宿主基因型、病原体毒力及环境条件。气候变化加剧了理解种子微生物群的必要性，因为热浪和干旱会在幼苗补偿能力有限时损害种子出土。单粒种子方法、无菌系统（gnotobiotic systems）和合成群落（SynComs）使得种子携带微生物功能及其对植物表型影响的因果验证成为可能。然而，种子相关微生物群稳定跨代传递的经验证据仍然有限。大多数研究仅记录了生活周期中的分类学重叠，而非追踪特定细菌菌株跨代的持久性。这一区分至关重要，因为种子同时传递垂直传播的微生物类群和由亲本环境塑造的宿主表观遗传状态。表征这两条不同的途径对于理解微生物和植物记忆如何独立或交互地影响跨代植物表现十分必要，尤其是在气候变化胁迫下。本综述综合了种子微生物群研究的最新进展，重点关注细菌。首先评估了传播和水平获得的证据，区分了附生和内生区室。其次，审视了从开花到贮藏和萌发的种子细菌群落组装过程，并评估了将种子细菌与早期生长、胁迫耐受性和病原体抑制联系起来的功能证据。进一步讨论了种子相关细菌分离株和种子聚焦的合成群落实验如何测试在种子上的定殖、向幼苗的转移以及对植物表型的影响。贯穿全文，强调了关键的知识空白，特别是关于种子相关微生物的多代追踪、厘清微生物与宿主表观遗传贡献，以及在田间条件和土壤群落融合下评估微生物组介导效应的持久性。
2. 2.
   种子相关细菌的传播与群落组装
   种子相关细菌群落可通过垂直传播和水平获得进行组装。垂直传播指微生物从亲本植物向子代种子的传递，可能实现跨代持久性；水平获得指种子在发育阶段或传播后从环境库中获龋本节评估了每条途径的证据，并在可能时区分种子附生菌与内生菌，因为这些组分在暴露历史及持久性和传播的可能性上存在差异。

2.1. 垂直传播与多代持久性

在谷物中，现有证据表明垂直传播仅适用于种子相关类群的一个受限子集，而非整个种子微生物群落。在水稻中，一项跨越两代、六个品种、五个植物微生境和四个地点的田间调查鉴定出一个持久的核心扩增子序列变体（ASVs）集合，包括Pantoea和Xanthomonas属的ASVs，并报告了亲本和子代种子分离株之间的高度基因组相似性，为垂直传播提供了有力证据。类似地，水稻的季节间研究确定了从种子到种子的29个细菌和34个真菌类群，并指出亲本种子和茎内圈是子代种子群落的主要来源。除谷物外，在Phaseolus vulgaris L.中也报道了类似证据，一项三代研究证明了核心种子携带微生物群的垂直传播，鉴定出22个无论母体干旱或营养胁迫如何都持续定殖于种子内圈的内生细菌类群。种子区室可作为调节继承微生物群组成的生物过滤器。微生物继承定义为在整个宿主生命周期中特定细菌菌株在种子内的持续维持。在水稻中，去除种皮改变了种子和幼苗中检测到的细菌和真菌群落，表明种皮是一个独特的微生物生态位。同期，对谷粒、外谷粒、外稃和外层外稃的分区特异性分析揭示了不同的细菌和真菌群落及与区室相关的组装模式，支持种子微生境对群落组装施加强烈过滤的观点。种子区室结构也可能为传播途径提供见解。例如，在佩德羯栎（Quercus robur）中，胚胎相关群落与幼苗叶际最为匹配，而果皮和根相关群落的多样性较低且组成不同，这表明胚胎和种皮相关微生物可能通过不同的传播途径促进幼苗定殖。微生物继承的证据不限于细菌，真菌同样可贡献于早期植物微生物组的垂直传播组分。新证据表明，种子微生物群可促进跨代胁迫记忆（即亲本环境依赖的微生物状态与子代种子相关，并与胁迫下的子代表现相关）。在小麦中，Azarbad等人明确分离了种子附生菌和内生菌，并结合多年降雨操纵田间实验，测试了种子相关群落是否传递干旱记忆。田间实验中，减少降雨最初降低了干旱敏感小麦品种的产量，同时选择了特定的种子细菌内生群落。在随后的世代中，其子代的种子微生物群若保留了与这些干旱适应群落相似的组成，则在后续水分胁迫下表现出增强的产量稳定性。然而，确定这种产量稳定性的微生物原因很困难，因为母体环境可诱导可遗传的宿主变化，包括DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传修饰。这些宿主内部变化发生在种子发育期间，可独立于微生物组影响子代表型。因此，建议未来垂直传播研究考虑：（i）使用区室靶向操作来区分附生菌驱动与内生菌驱动效应（例如表面灭菌后定向再接种，以及在可行时进行胚胎聚焦递送）；（ii）将微生物组操作与可遗传宿主编程特征（例如甲基化组分析）相结合，以测试微生物效应是独立的还是共变的。这些方法将有助于分离传递的细菌与宿主内部表观遗传编程的效应。

2.2. 水平传播

水平获得（即微生物类群的环境驱动获得）预计会对种子微生物多样性做出重大贡献，因为在植物发育阶段和种子传播期间，种子会遇到多个外部库（如土壤、空气/尘埃、降雨、昆虫）。对于非作物植物，种子传播过程可通过将种子移动到不同微位点而进一步影响微生物暴露。动物介导的传播以及传播后的处理或捕食可产生非随机的沉积网络，重新分配种子到不同栖息地。风媒传播同样可改变种子在不同微位点的截获和滞留，从而在萌发前改变对局部尘埃和土壤相关来源的暴露。水稻发育过程中水平获得的直接证据来自Chen等人的研究，他们利用qPCR、16S分析和显微镜观察显示，细菌获得在圆锥花序抽穗和开花前后达到峰值。许多获得的细菌源自外部环境，并定位于颖果和稃片之间。在无菌条件下生长的幼苗中检测到这些细菌，支持了从种子到幼苗的水平获得细菌的垂直持久性。一旦种子接触非无菌土壤，种子和土壤群落就会融合并重新组装。这一过程通常是不对称的，土壤类群占主导地位，少数种子携带的类群得以持久。在Brassica napus中，只有一小部分种子携带的类群在土壤中定殖了幼苗，这解释了为何种子阶段的群落组装模式在播种后不一定会持续。播种后，萌发改变了周围的种子环境。种子分泌物施加了营养驱动的选择，因为种子从干燥、低活性的状态转变为活跃代谢的状态。吸胀（imbibition）（干燥种子的初始吸水）和早期储备动员（开始利用储存的碳和氮以促进出土）产生短暂的养分脉冲，有利于快速生长、资源响应型的类群。宏基因组预测和分离株测定表明，在幼苗出土期间富集的细菌比耗竭的类群在种子分泌物样底物上具有更高的生长潜力。因此，快速生长的细菌属（如Pantoea、Enterobacter、Erwinia、Rahnella）被富集，而生长潜力较低的种子相关谱系（如Staphylococcus、Carnobacter和Sanguibacter）则被耗竭。在大豆中，Gerna等人通过使用外源脱落酸（ABA）抑制萌发同时允许水合作用，将吸胀与萌发代谢分开。吸胀将种皮衍生的细菌重新分配到种子各区室，而萌发代谢增加了丰富度并有利于富营养型（copiotrophic）类群。Pantoea agglomerans在代谢物确定的培养基上也比Rhodococcus fascians生长更快，支持生长速率差异作为群落重组的一个促成因素。总之，这些研究支持了一个混合传播模型：一小部分种子相关谱系可在亲本和子代种子中检测到，而大部分种子相关多样性是从环境来源获得的，然后在萌发期间，尤其是土壤接触后经过强烈的再过滤。一个主要局限是许多研究仅对一个终点（例如干种子或幼苗）采样，而非量化完整的获得→成熟（干种子）/贮藏→萌发→土壤暴露序列。为了解决这个问题，我们建议未来的研究报告四个演替阶段的成果：（i）进入发育中种子的获得（包括生殖发育期间的进入时机和定位）；（ii）通过成熟和贮藏的持久性（包括绝对微生物载量和活力的变化）；（iii）萌发期间的增殖，明确定义为从干种子到吸胀/萌发状态特定类群绝对丰度的增加（不仅仅是相对丰度的变化）；（iv）土壤暴露后的定殖，量化为在现实条件下种子-土壤混合后，在幼苗中仍可检测到的种子携带类群的比例。最后，仍需要直接的实验证据来确定不同的种子微生境（如谷粒内部和稃片或外层）是否优先定殖特定的幼苗区室。尽管水稻种子显示出强烈的区室特异性群落结构，但这些区室促进幼苗定殖的途径仍很少通过区室靶向追踪或操作进行测试。

1. 3.
   种子到幼苗转变期间种子相关细菌的功能角色
   本节聚焦于种子微生物组研究中常报告的三个实验可操作的结果：（i）对萌发时间和早期生长的影响，（ii）在定殖期间对养分和胁迫相关性状的调节，以及（iii）对病原体的早期保护。

3.1. 促进萌发和早期生长

一部分种子微生物群在干种子中保持存活但代谢不活跃或活性极低，并在萌发期间变得活跃，然而触发这种转变的线索仍不清楚，需要直接的机制测试。在吸胀和早期储备动员期间，种子从一个干燥、低活性的生境转变为一个富含种子分泌物的营养丰富微环境，这可通过有利于能够利用这些释放底物的快速生长类群来重组种子相关微生物群。在水稻中，杂交种子的内生群落与其亲本系不同，并且使用杂交种内生分离株的接种实验比使用亲本来源分离株的接种对萌发相关性状有更大的改善。扰动-救援设计通过显示去除常驻种子微生物会损害早期表现，并且重新引入定义的种子来源菌株可以恢复部分植物表型，从而加强了因果推断。在玉米中，次氯酸钠消毒减少了常驻种子细菌群落并延迟了萌发和幼苗生长；然而，用种子来源的合成群落重新接种部分恢复了幼苗建植，支持了种子携带细菌对早期植物表现的直接贡献。在多物种牧草调查中，Dai等人分离了Bacillus subtilis（Es-1）和Pantoea agglomerans（Ed-3），并测试了对寄主萌发率和幼苗鲜重的影响，说明种子来源分离株可以改变早期生长指标，但效果因植物物种而异。最后，种子内生菌可能在作物模型之外也有助于早期生长。在铅锌超积累植物Noccaea caerulescens中，跨污染地点的种子内生菌分析表明群落结构广泛保守，并且用培养的种子分离株（Sphingomonas vulcanisoli）接种增加了模式植物试验中的根长。总之，这些研究支持萌发作为一个实验可操作的窗口，其中（i）种子生理学改变资源景观，（ii）早期定殖者可以获得优先权效应，以及（iii）微生物活动可以影响植物表型（例如萌发时间、早期生物量）。

3.2. 养分动员与胁迫缓解

种子相关细菌可通过菌株特异性功能影响植物早期建植期间的养分和胁迫相关性状，这些功能调节微量营养元素可用性和植物胁迫信号。一个胁迫环境的例子来自Vicia sativa，Xu等人在冷、盐或PEG模拟干旱胁迫后分析了种子来源群落，并将类群分为胁迫广适型（如Methylobacterium、Pantoea和Sphingomonas）与胁迫特化型（如Stenotrophomonas、Geobacter和Leptotrichia）。他们随后用培养的 representative构建了接种物，并显示广适型接种物在多种胁迫条件下改善了幼苗生物量，而特化型接种物在与相应胁迫匹配时表现最佳。这些发现支持了菌株选择应针对目标胁迫量身定制，而不是假设存在单一的通用种子生物刺激剂。除了对植物生长的影响，种子内生菌接种研究还报告了离子稳态的变化，这是与胁迫耐受性密切相关的生理性状。在大麦中，Abideen等人用两种种子来源的内生菌（鉴定为Pseudomonas sp.和Pantoea sp.）接种植物，并在干旱条件下量化了矿质离子积累。接种植物表现出比未接种对照更高的地上部和根部K?浓度以及更高的K?/Na?比率。极端生境中的种子微生物群也表明在种子定殖期间存在强烈的环境过滤。在寄生植物Cistanche armena（盐碱、干旱生境）中，Petrosyan等人报道可培养的种子内生菌以产孢子、耐盐/嗜碱的Bacillus spp.为主，并鉴定出具有促植物生长性状的Pantoea和Stenotrophomonas分离株，包括生长素产生、ACC脱氨酶活性和有机酸产生。在番茄中，Dargiri和Samsampour用真菌孢子和/或细菌悬浮液预处理表面灭菌的种子，然后在高压灭菌的泥炭/蛭石中生长幼苗，并量化了四叶期（45天）的性状。他们报告称几种真菌-细菌组合增加了生长指标（鲜/干生物量、高度）并改变了多种植物生理/生化性状。这支持了多界（multi-kingdom）菌群作为种子递送的胁迫调节因子的可行性。总的来说，最相关的种子证据支持一个以菌株为中心（strain-centred）的模型，其中特定的可培养微生物可以在幼苗期改变养分和胁迫相关性状。然而，要确定田间相关性，将需要量化从种子到特定幼苗区室的绝对定殖动态，并在非无菌土壤中重新评估候选菌株，因为那里的竞争和稀释预计最大。

3.3. 病原体抑制与生物防治

种子相关微生物可在幼苗出土期间降低病原体压力，因为它们在种子-幼苗过渡期已经存在，此时病原体感染和竞争性筛选最强。生物防治（biocontrol）指的是由微生物驱动的、直接或间接抑制病原体的保护。在大麦中，Ajayi等人分离了细菌种子内生菌，并显示了体外对Fusarium graminearum的抑制，支持了种子可携带拮抗菌株的观点。在萝卜中，核心种子微生物群在引入病原体Xanthomonas campestris（Xcc8004）期间保持了分类学稳定性，因为病原体利用了与主要常驻菌不重叠的碳源。相比之下，本地Stenotrophomonas rhizophila菌株与病原体显示出更大的资源重叠，并被提议为可通过生态位抢占（niche pre-emption）限制病原体建植的候选者，有效地先到并占据病原体所需的资源。虽然生态位抢占依赖于资源消耗，种子携带的保护也可以通过靶向破坏病原体信号传导来发挥作用。在水稻中，种子传播的内生菌Sphingomonas melonis赋予对幼苗枯萎病病原体Burkholderia plantarii的抗性。这种保护是由邻氨基苯甲酸（anthranilic acid）的产生介导的，该代谢物通过干扰RpoS依赖性调控来减弱病原体毒力。除了靶向信号干扰，种子微生物群还通过多种拮抗谱系和群落水平的抑制作用提供广谱防御。在幼苗试验中，种子来源的Bacillus cereus和B. toyonensis直接抑制Fusarium solani和F. oxysporum，减少根腐症状，同时增强萌发和幼苗生物量。同样，水稻种子内圈含有拮抗性的Burkholderia和Pantoea菌株，可抑制幼苗枯萎病真菌，为种子应用的生物防治提供了功能性候选来源。在菠菜中，对Globisporangium ultimum猝倒病的自然抑制作用由Massilia和担子菌酵母（如Vishniacozyma和Filobasidium）的富集驱动。在马铃薯中，当与 aerial multispectral imaging结合时，种薯微生物组的分类学组成能够实现作物活力的高通量建模。总之，这些发现将种子微生物群定位为一个生物组件，其中特定的种子微生物和/或群落特征可能增强植物性状。然而，当前研究的一个主要差距是基于实验室的拮抗作用与实际宿主建植期间保护性类群生态持久性之间的脱节。大多数研究依赖于体外测定或简化的幼苗模型，未能追踪保护性菌株是否成功定殖并在植物中随时间持久存在。为了弥补这一差距，研究应考虑提供拮抗机制的空间分辨率，具体区分外部种皮上的竞争、内部内圈的定殖和占据，以及种子周围土壤-种子界面的抑制。这种细节水平是确定种子微生物是否能够承受土壤来源群落整合的代谢和分类压力的必要条件。

1. 4.
   宿主基因型、驯化与环境效应
   本节详细说明了控制微生物招募的宿主遗传学，并分析了这些可遗传途径在作物驯化过程中是如何被重组的。我们进一步评估了母体环境胁迫和收获后贮藏作为选择性屏障，决定了种子传播的主要接种物的活力和定殖效率。这些累积的选择层定义了可用于垂直传播和早期幼苗建植的微生物谱系的分类学组成和功能潜力。

4.1. 宿主基因型与育种的影响

宿主基因型可以塑造种子相关微生物群的群落组装，但这种效应的强度取决于研究是针对种子内生菌还是种子附生菌。在冬油菜（Brassica napus）中，种子细菌群落结构在不同品种间存在差异，并且在使用定义菌株的表面灭菌试验中也观察到了品种特异性反应。例如，Pseudomonas brassicacearum（CKB26）在种子上的定殖表现出品种依赖性，并且幼苗生长反应因品种而异。除了植物品种之间的差异，特定的育种历史（如杂交）也决定了内部细菌库的组成。在水稻中，杂交种子包含一组与亲本植物不同的内生细菌，这些微生物变化为下一代带来了直接益处，其中从杂交种子分离的细菌比从亲本系分离的细菌更能有效促进萌发。从野生二粒小麦（Triticum dicoccoides）到驯化面包小麦（T. aestivum）的过渡导致种子携带细菌丰富度和分类多样性的减少。虽然野生二粒小麦保持了可预测的微生物概况，但驯化品种表现出高度的种间随机性。无菌测定进一步证实，现代育种产生了多样性较低的最初种子相关微生物群，为现代小麦后代提供的定殖源不如其野生祖先可靠。这些实证结果验证了微生物组基因（M gene）育种框架，将宿主遗传学确定为通过微生物选择改善作物健康的主要靶标。在此框架内，宿主招募有益微生物的能力被视为一种可选择的性状，不同于传统的抗性基因。通过靶向调节种子微生物组垂直传播的特定宿主基因，育种者可以有意识地选择具有更稳定、功能性生物防御的品种。

4.2. 驯化与微生物组进化

谷物（特别是小麦、大麦和黑麦）的驯化已被证明驱动种子携带细菌多样性的显著增加，同时降低种子微生物共现网络的复杂性和连通性。栽培作物中的这种分类学多样化以广义的、与人类相关的类群（如Cutibacterium）的富集为特征，这与野生祖先中更结构化和稳定的微生物组合形成对比。这些结构变化延伸到幼苗阶段，育种历史决定了继承和环境中微生物之间的竞争平衡。在小麦中，野生祖先表现出更高的垂直传播类群定殖效率，而现代品种更依赖从土壤微生物库招募来填充早期根际和内圈。在Cannabis sativa中也观察到了类似的驯化连锁重组，集约化育种降低了种子携带细菌群落的分类多样性并增加了同质性。这种转变表现为细菌丰富度的显著下降，现代杂交种的香农多样性低于祖先地方品种。这些组成变化与专门防御性内生菌的丧失有关，这些内生菌保护新生幼苗免受土传病原体侵害。在玉米中，本地地方品种的种子比现代杂交品种携带显著更高的内生微生物丰度和更大的分类多样性。通过成对相互作用测定的功能筛选确定，地方品种来源的内生菌具有增强的竞争性状，特别是通过对土壤细菌的高频拮抗作用，而这种作用在现代杂交分离株中基本不存在。最有效的拮抗菌株被鉴定为Burkholderia spp.，这是一个仅在本地地方品种种子中检测到的属。通过花喷洒实验引入Paraburkholderia phytofirmans PsJN可绕过宿主屏障定殖单子叶植物（玉米、小麦）和双子叶植物（大豆、辣椒）的种子胚胎。在小麦中，这种内部定殖加速了生殖发育，导致第一代子代的开花显著提前。然而，在后续世代的种子中未检测到PsJN，证实跨宿主定殖和即时功能效益并未转化为稳定的垂直传播。这些结果表明，有效的微生物组工程取决于特定功能性状的递送，以及能够确保这些微生物菌株或菌群跨代持久性的宿主基因型的选择。成功的整合需要宿主在连续的生活周期中维持稳定的微生物组，将工程化成员从瞬时接种物转变为植物全生物体的可遗传组成部分。

4.3. 母体环境与胁迫调节

母体环境（母本植物在开花、种子灌浆和成熟期间经历的生物和非生物条件）可通过改变（i）能够进入生殖组织和发育中种子的微生物，以及（ii）决定哪些类群持续到成熟的种子内部条件来转移种子相关群落。在水稻中，跨环境的田间尺度采样报告称种子微生物群与气候相关变量（包括种子湿度和冬季温度）协变。农艺管理也可作为一种母体环境，因为它改变了植物生长过程中的暴露历史（土壤生物群、农药制度和田间小气候）。在水稻中，常规与有机生产的比较报告称，常规生产种子中内生细菌多样性较高，而有机生产种子中真菌多样性较高。功能筛选和接种试验表明，母体/胁迫背景也可偏向富集具有可测量干旱相关效应的菌株水平候选者。在小麦中，来自耐旱植物的种子相关分离株（包括Curtobacterium flaccumfaciens和Arthrobacter spp.）在对照实验中改善了干旱下的幼苗生长。许多研究汇集种子细菌，掩盖了胁迫效应是源于种子表面还是内部组织，以及作为母体的一部分实际转移到幼苗的是哪个组分。因此，需要区室特异性定量和靶向扰动（表面耗竭/再接种与内部递送）来将母体环境与确定的种子组分联系起来，并测试哪个组分影响植物表型。在小麦中，Azarbad等人分离了种子附生菌和内生菌，并将干旱历史与内生群落的变化联系起来。

4.4. 种子贮藏条件的影响

收获后处理有助于种子相关细菌群落的重组，因为干燥和贮藏对储存种子中哪些类群保持存活和可检测施加了时间和温度依赖的过滤。在水稻中，Dutta等人追踪了成熟期间的种子内生群落，然后将两个品种收获的种子储存在4°C与15°C下。他们量化了可培养细菌并分析了随时间变化的群落组成，显示可培养性在成熟和贮藏期间发生变化，并且贮藏温度与贮藏后检测到的种子细菌群落差异相关。重要的是，当幼苗在无菌条件下生长时，地上部和根部的细菌组成因种子储存在4°C还是15°C而不同。额外的证据表明，干燥本身可能是一种强烈的扰动，而不是中性的预处理步骤。在大豆中，Chandel等人应用标准干燥方案（15°C，15%相对湿度，1个月）后进行贮藏，观察到干燥改变了几个优势属的相对丰度，包括Pseudomonas、Pantoea、Curtobacterium、Sphingomonas和Massilia的较大变化。随后的贮藏温度影响了多样性随时间的保持方式：在测试的温度（-20°C、4°C、室温）下，-20°C通常比温暖条件减缓了多样性损失，而一些类群表现出温度敏感性（例如Massilia在该数据集中低温贮藏下下降）。总之，这些研究证明有必要将干燥和贮藏参数作为重要变量（温度、湿度、持续时间）进行报告，因为它们可显著重塑可用于定殖萌发幼苗的种子携带细菌。

1. 5.
   细菌分离株、可培养性及对种子微生物组工程的意义
   微生物组工程指的是对宿主相关微生物群落进行实验引导的修饰以改变其组装或功能。在实践中，这通常通过引入定义的菌株作为合成群落来完成，以便可以添加、移除或替换单个成员，以在受控条件下测试微生物群落组成与植物结果之间的关系。微生物组工程的一个实际限制是可培养性，定义为在定义的实验室条件下将植物相关微生物作为活分离株回收的能力。这很重要，因为菌株水平的功能（生长性状、代谢物产生、胁迫耐受性）需要分离株，而不仅仅是扩增子序列。在植物内圈研究中，培养收集品已被证明仅能跨宿主和组织恢复一小部分属（Bacillus和Pseudomonas），而许多测序检测到的谱系仍很少被分离。种子聚焦的数据集说明了在标准培养方法下这种差距有多大。高地大麦种子的培养依赖性分离从表面灭菌的种子中产生了86个分离株，大多数归为Bacillus，而对相同种子材料的16S rRNA分析则以变形菌门（Proteobacteria）和更精细分辨率的肠杆菌科（Enterobacteriaceae）为主。这种不匹配被解释为培养偏差。种子系统研究表明，微生物的可培养性高度依赖于培养策略。种子环境培养基可以扩大可培养群落的份额。在萌发的大豆中，Gerna等人设计了多种固体培养基来模拟种子内圈，并鉴定出246个分离株；他们还报告胚胎轴比子叶具有更高的丰富度和更多独特属，这突出了可培养的内容取决于采样的种子区室。他们进一步显示不同的种子批次产生的重叠类群很少，这与可培养内生池的批次间高度变异性一致。当分离优先级由细菌在种子中的积累位置和向幼苗的转移能力指导时，可以使其更具工程相关性。例如，绘制种子微生境图并确定与下游幼苗定殖相关的区室，为选择更可能在种子到幼苗转变中起作用的分离株提供了合理依据，而不是组装由易生长类群主导的微生物菌群。接种Bacillus subtilis种子的试验已在多种作物-胁迫环境中进行（包括盐胁迫下的玉米和干旱下的小麦），在对照试验中早期幼苗性状有可测量的改善，但结果因特定菌株、剂量和测试系统而异。同样，种子/幼苗施用Pseudomonas fluorescens已被报道可增强萌发/幼苗活力并有助于作物建植环境中的病害抑制，其性能同样取决于制剂和菌株特性。种子微生物组工程不应默认为一小组容易培养的属，因为种子相关研究也包括超出Bacillus和Pseudomonas的菌株水平例子。例如，小麦相关的Variovorax分离株（P1R9）在单独使用或作为菌群一部分应用时改善了萌发和早期幼苗性状。同样，对Azospirillum brasilense种子接种的反应取决于接种菌株和种子性状（如种子大小），说明宿主性状可在最早发育阶段调节细菌功效。展望未来，这些例子提供了宝贵的证据来量化种内菌株多样性，并测试在植物环境中的持久性和功能是否可归因于菌株特异性而非属水平特性。
2. 6.
   用于种子微生物组工程的合成群落（SynCom）
   种子合成群落有助于测试哪些种子携带菌株改变幼苗微生物群落组装和植物性状，以及这些效应出现在哪个阶段。在本节中，我们提出了种子聚焦的合成群落实用工作流程。

菌株选择与SynCom设计。种子聚焦的合成群落通常从分离和培养种子细菌开始。为了最大化功能潜力，选择应从种子表面和内部区室回收的分离株中提取，确保种子相关微生物群的完整代表性。在可能的情况下，SynCom设计应包括属内多样性（同一属的多个菌株），以测试定殖和植物反应是否具有菌株特异性，而非一般分类学标签。然后，SynCom设计使用定义的成员和丰富度来测试微生物群落背景如何影响幼苗微生物群的组装。在萝卜中，SynCom实验表明种子到幼苗的传播在菌株间差异很大，并随群落丰富度而变化，幼苗性状分布（包括异常幼苗）也取决于群落背景。这些结果可能支持使用丰富度梯度，不是为了声称更多的多样性更好，而是为了梳理哪些菌株是稳健的定殖者，哪些对群落背景敏感，以及哪些在受控条件下驱动阳性或阴性早期表型。

种子灭菌与包衣。表面灭菌被广泛用于减少背景变异并实现菌株追踪，但它也移除了部分常驻附生群落并改变了起始条件。因此，应报告灭菌步骤并证明其合理性，同时配合适当的对照。由于种子包衣/接种设定了每个菌株的起始丰度，研究应报告接种密度并确认种子上的接种后回收（例如每粒种子的菌落形成单位）。这很重要，因为起始丰度可强烈影响哪些菌株在萌发后建植。一个补充设计是在不去除常驻微生物群的情况下接种种子，这测试了合成群落在存在本地种子群落的情况下的作用。在紫花苜蓿中，Dissanayakalage等人接种了未灭菌的种子，并观察到处理相关的幼苗性状和细菌群落特征变化。然而，在没有菌株追踪的情况下，数据无法区分接种菌株的持久性与常驻群落介导的间接效应。

萌发窗口追踪与早期结果。在受控实验室条件下，种子施用的SynComs可强烈塑造幼苗微生物群落，这与优先效应一致。一种机制解释是萌发释放了短暂的种子分泌物脉冲，增加了种子周围的局部资源可用性，有利于快速生长的菌株。这就是为什么种子SynCom研究应量化整个萌发窗口的定殖动态和植物结果，而不是报告单一终点。除了外部接种，垂直进入方法旨在在种子组织内部建立菌株。在小麦中，标记的内生菌实验支持通过植物生命周期追踪引入的谱系并在子代种子中再次检测的可行性，表明当实现内部建植时，种子介导的持久性是可能的。

田间过渡、耐久性与生命周期效应。从对照测定到土壤生长植物（特别是在田间条件下）转化的主要障碍是，在萌发期间观察到的效应在土壤暴露后通常会减弱，此时种子和土壤来源的群落混合和重新组装，土壤类群占主导地位。尽管全植物生命周期和多代测试研究较少，但现有的种子接种工作表明，SynCom成员在植物发育后期可能变得稀有甚至检测不到，同时仍对群落组装和/或植物表现留下遗留效应，包括在下一粒种子世代中可检测的信号。因此，将持久性（引入菌株的持续可检测性）和遗留效应（在引入菌株变得稀有或无法检测后仍然存在的下游变化）视为不同的结果非常重要，因为它们意味着不同的机制和不同的设计目标。Garrido-Sanz和Keel在微观世界中设计了可重复的小麦根际群落，并报告称可遗传的种子携带根际微生物组可以超越本地土壤微生物成为其系统中的主导根际来源。他们将其与（i）生态位划分（即类群专门利用不同底物，减少直接竞争）和（ii）促进/交叉取食（即一个类群促进另一个类群的生长）联系起来。这种机制正是SynCom研究在声称可预测的SynCom设计时应力求达到的证据水平。

1. 7.
   展望：面向可持续农业的种子微生物组工程
   比较种子SynCom研究的一个实用方法是使用第6节讨论的相同的逐步工作流程报告结果。至少，研究应分离：（i）初始建植（在种子上或内部可检测到），（ii）萌发期间的增殖（菌株绝对丰度的增加，而不仅仅是相对丰度的变化），（iii）幼苗器官定殖（根和地上部/叶），以及（iv）土壤暴露后的持久性（种子-土壤混合后的持续可检测性）。除了促进幼苗出土，产量缓冲和作物品质在种子微生物组工程中仍未得到充分开发。土壤微生物组特征可以预测收获时小麦烘焙品质性状，支持微生物组知情的质量预测，但尚未建立种子微生物组机制。这就提出了一个种子聚焦的问题：工程化的种子微生物群落能否改变最终产品的数量和质量（例如营养成分或加工性状）？如果能，负责的微生物是否需要在萌发窗口之外持久存在，还是早期生命效应就足够了？解决这个问题需要将定义的种子微生物组操作与跨植物发育的微生物追踪以及收获时标准化的数量和质量表型分析相结合。
2. 8.
   结论
   种子相关细菌通过促进养分动员和抑制环境病原体来支持植物建植和抗逆性。这些微生物群落在开花阶段启动，在种子发育过程中巩固，并在萌发时重新激活以促进早期幼苗微生物群落组装和植物全生物体的初始建植。过去十年揭示，种子微生物群是可遗传的、动态的且可操控的，受宿主遗传学、母体环境和驯化的塑造。虽然选择性育种和现代种子卫生无意中缩小了微生物多样性，但微生物组辅助育种和基于SynCom的接种的出现为恢复和优化这些隐藏的盟友提供了新的机会。展望未来，可持续作物生产的未来可能既取决于微生物继承，也取决于植物遗传学。最终，理解和工程化种子微生物组可以将种子从种质单位转变为一个活的生物载体，携带着宿主遗传和微生物的双重记忆，这对植物适合度和可持续农业至关重要。