用于区分泰国Simulium asakoae的多重PCR及其在S. asakoae种团中病原体的分子检测

《Current Research in Parasitology & Vector-Borne Diseases》：Multiplex PCR for the differentiation of Simulium asakoae and molecular detection of pathogens in the S. asakoae species group in Thailand

　　

一种叮咬人类的黑蝇，Simulium (Gomphostilbia) asakoae Takaoka & Davies, 1995，与S. asakoae种团的其他某些成员一起，作为多种病原体的媒介具有医学和兽医学重要性。然而，由于相关成员之间形态高度相似以及cox1条形码（cox1 barcoding）的限制，准确的物种鉴定仍具挑战性。为应对这一挑战，本研究开发了一种基于cox1基因（cox1 gene）的多重PCR（multiplex PCR）检测方法，用于区分S. asakoae。此外，还对从泰国北部清迈省采集的S. asakoae种团中流行的多种病原体进行了分子检测。该多重PCR检测方法使用两个等位基因特异性正向引物（allele-specific forward primers）与通用cox1引物（universal cox1 primers）作为内参（internal control）进行开发。该检测方法显示出100%的灵敏度和特异性，成功地将S. asakoae与同一物种组中的其他泰国相关物种区分开来。对100个个体标本和20个S. asakoae种团混合样本的病原体筛查显示，Leucocytozoon的感染率最高（个体中14%，混合样本中最低感染率（MIR）8.5%），其次是锥虫科（trypanosomatids）（个体中10%，混合样本中MIR 4%）和丝虫科线虫（filarial nematodes）（个体中5%，混合样本中MIR 2.5%）。分子分析进一步确认了在泰国S. asakoae种团中首次检测到Leucocytozoon sabrazesi、锥虫科（Trypanosomatidae spp.）（包括Leptomonas spiculata）、Onchocerca sp. type I以及一种可能的新Onchocerca sp.。据研究人员所知，本研究提供了首个用于快速、正确鉴定S. asakoae的多重PCR检测方法，并确认了S. asakoae种团中多种病原体的流行，从而支持泰国加强监测和媒介控制计划。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**

黑蝇（Diptera: Simuliidae）是全球第三大重要的病媒节肢动物，已知超过2400个正式命名物种，其中约10–20%被认为对人类和动物具有重要危害。至少26种黑蝇被认定为蟠尾丝虫（Onchocerca volvulus）——人类蟠尾丝虫病（河盲症）的病原体——的媒介。此外，黑蝇还传播禽类宿主中的血孢子虫（Leucocytozoon属）以及多种兽医学上重要的病原体，如锥虫（Trypanosoma spp.）、水疱性口炎病毒和丝虫科线虫。在泰国，黑蝇动物区系记录良好，至少有149个命名物种，均属于Simulium属。其中，Simulium asakoae（属于Gomphostilbia亚属）因其叮咬人类和动物（如鸡）并作为多种病原体（包括未鉴定的丝虫和血孢子虫）的潜在媒介而备受关注。然而，雌性S. asakoae的鉴定因与同一种团其他成员的形态特征重叠而极为困难。此外，近期的研究表明，cox1条形码（cox1 barcoding）并非有效的物种鉴定遗传标记。因此，迫切需要开发替代鉴定方法，特别是在S. asakoae种团成员与S. asakoae共存的区域。多重PCR（multiplex PCR）是一种简单、快速、廉价且可靠的工具，已在多种昆虫媒介的鉴定中成功应用，但此前从未用于黑蝇物种的鉴定。本研究旨在开发首个基于cox1基因（cox1 gene）的单步多重PCR检测方法，以区分S. asakoae与泰国S. asakoae种团中的其他相关物种，同时对野生雌性黑蝇中流行的主要病原体（丝虫科线虫和血孢子虫）进行分子检测。论文发表在《Current Research in Parasitology》。

**主要关键技术方法**

研究人员开发并验证了一种基于cox1基因的多重PCR检测方法，用于区分S. asakoae与泰国S. asakoae种团中的其他相关物种。样本队列来源包括：从泰国多个地点采集的幼虫、成虫及野生雌性黑蝇（总120个标本用于验证），以及从清迈省Doi Saket县Pang-Bong村（北纬18°59’4”，东经99°20’6”，海拔990米）采集的100个个体和20个混合样本（每池10个标本）用于病原体检测。关键技术方法包括：使用通用cox1引物进行DNA条形码和系统发育分析以确定物种；基于155个cox1序列设计等位基因特异性正向引物（ASK-F1M和ASK-F2M），并引入3'端第三个核苷酸错配以增强特异性；优化多重PCR条件（引物浓度、退火温度和时间等）；通过巢式PCR（nested PCR）检测Leucocytozoon（cytb基因）和锥虫科（18S rRNA基因），以及常规PCR检测丝虫科线虫（cox1基因）；对阳性样本进行Sanger测序和BLAST搜索及系统发育分析（邻接法和最大似然法）。

**研究结果**

**3.1. 多重PCR的开发**

**3.1.1. 黑蝇标本、BLAST搜索和系统发育分析**：通过cox1条形码对120个S. asakoae种团标本进行分子鉴定，鉴定出52个独特单倍型。BLAST搜索显示13个单倍型（45个标本）与S. asakoae相同或相似，其余39个单倍型（75个标本）与S. asakoae种团的其他成员高度相似。系统发育分析将单倍型分为S. asakoae和非S. asakoae两组，并发现S. asakoae序列未形成单系群，而与越南的S. chaudinhense等物种聚类。

**3.1.2. 引物设计**：基于cox1比对设计了两个特异性正向引物ASK-F1M和ASK-F2M，并引入3'端第三个核苷酸错配以增强特异性。通用cox1引物（LCO1490和HCO2198）作为内参对照。

**3.1.3. 多重PCR**：优化后的多重PCR反应体系（20μl）包含1×Taq缓冲液（含(NH₄)₂SO₄）、1U Taq DNA聚合酶、2mM MgCl₂、0.2mM dNTPs、0.3μM LCO1490、0.2μM HCO2198、0.05μM ASK-F1M和0.1μM ASK-F2M。热循环条件：94°C 2分钟；40个循环（94°C 30秒，52°C 15秒，72°C 30秒）；72°C 5分钟。该检测方法可区分S. asakoae（产生262 bp、463 bp或两个特异性条带）和非S. asakoae（仅产生709 bp共同条带）。

**3.1.4. 验证**：使用120个S. asakoae种团标本（包括不同生活史阶段和采集地点）进行验证，所有标本均成功扩增，且条带模式与cox1测序分析完全一致。S. asakoae标本（45个）中，37个产生三条带，少数产生两条带；非S. asakoae标本（75个）仅产生709 bp条带。灵敏度和特异性均为100%。

**3.2. 病原体的分子检测**

**3.2.1. S. asakoae种团中检测到的病原体**：在20个混合样本中，Leucocytozoon阳性17池（最低感染率MIR 8.5%），锥虫科阳性8池（MIR 4%），丝虫科线虫阳性5池（MIR 2.5%）。在100个个体样本中，Leucocytozoon阳性14个（感染率14%），锥虫科阳性10个（10%），丝虫科线虫阳性5个（5%）。此外，发现两个个体同时感染锥虫科和Leucocytozoon（2%）。

**3.2.2. S. asakoae种团中检测到病原体的BLAST搜索**：锥虫科阳性样本鉴定出4个单倍型：TP-01和TP-02与Trypanosoma avium最相似（>99%相似性），TP-03与Trypanosomatidae sp.相似（99.80%），TP-04与Leptomonas spiculata相同。Leucocytozoon阳性样本鉴定出15个单倍型：LC-05至LC-12与Leucocytozoon sabrazesi最相似（98.95–99.79%），LC-13和LC-14与L. schoutedeni相同，LC-01至LC-04与未鉴定Leucocytozoon spp.相似。丝虫科线虫阳性样本鉴定出7个单倍型：FL-03至FL-06与Onchocerca sp. type I最相似（99.69–99.85%），FL-01和FL-02与Filarioidea sp.完全匹配，FL-07与O. skrjabini相似（92.43%）。

**3.2.3. S. asakoae种团中检测到病原体的系统发育分析**：Leucocytozoon的cytb系统发育树将14个单倍型分为四个分支（I-IV）：Clade I包含LC-01至LC-03（与Leucocytozoon spp.聚类），Clade II包含LC-13和LC-14（L. schoutedeni），Clade III包含LC-04（独支），Clade IV包含LC-05至LC-12（L. sabrazesi）。锥虫科的SSU rRNA系统发育树将4个单倍型分为两个分支：Trypanosomatinae分支包含TP-01和TP-02（与T. avium聚类），Leishmaniinae分支包含TP-03（与Trypanosomatidae sp.聚类）和TP-04（与L. spiculata聚类）。丝虫科线虫的cox1系统发育树将7个单倍型分为三组：FL-01和FL-02与Filarioidea sp.聚类；FL-03至FL-06与Onchocerca sp. type I聚类；FL-07与O. ramachandrini呈姐妹群关系。

**3.2.4. 用于病原体筛查的黑蝇分子鉴定**：通过多重PCR，100个个体黑蝇中23个为S. asakoae，77个为非S. asakoae。27个病原体阳性黑蝇中，21个为非S. asakoae，6个为S. asakoae。cox1条形码进一步鉴定出6个单倍型，分别与S. nanthaburiense、S. myanmarense、S. asakoae和S. pitasawatae高度相似。系统发育分析将单倍型分为四组，对应上述物种。

**讨论与结论总结**

**讨论部分**：本研究首次开发了用于区分S. asakoae的多重PCR，填补了黑蝇快速鉴定工具的空白。该检测方法具有100%灵敏度和特异性，比传统方法更快速、经济，适用于常规媒介控制计划和昆虫学研究。引物设计中引入的3'端错配技术增强了特异性，而通用cox1引物作为内参可监测DNA提取和扩增过程，避免假阴性。由于S. asakoae遗传多样性高，设计两个等位基因特异性反向引物减少了扩增失败。但该检测方法对越南种群可能适用性有限，因为越南S. asakoae种团物种与S. asakoae遗传差异极小，未来需纳入越南序列数据改进。病原体检测揭示Leucocytozoon、锥虫和丝虫在S. asakoae种团中流行，与这些成员的广谱宿主取食行为（包括禽类和哺乳动物）一致。在头部和胸部检测到病原体DNA提供了更强的媒介-病原体关联证据，但仅靠分子检测不能确认媒介能力。本研究鉴定了至少4个种团成员（S. nanthaburiense、S. myanmarense、S. asakoae、S. pitasawatae）作为潜在媒介。混合样本的感染率低于个体样本，可能因稀释效应和PCR抑制。Leucocytozoon感染率最高，其中L. sabrazesi首次在S. asakoae种团中检测到，此前因引物错配导致假阴性。锥虫科中T. avium最流行，且首次在黑蝇中检测到Leptomonas spiculata和一种未鉴定Leishmaniinae物种。丝虫中Onchocerca sp. type I首次在S. asakoae种团中检测到，提示其分布更广，需针对多种黑蝇物种进行控制。此外，发现一种可能的新Onchocerca种，与O. ramachandrini关系密切，推测可能与野猪宿主有关。同时感染两种血孢子虫的现象也观察到，具有流行病学意义。总体而言，研究强调了基于分子筛查的病原体流行病学监测的必要性。

**结论部分**（翻译原文第5节）：本研究在黑蝇媒介鉴定方面取得了重要进展，提供了一种实用工具，解决了当前S. asakoae形态学和DNA条形码鉴定方法的局限性。与DNA测序相比，多重PCR节省的时间和成本使大规模研究更加可行，可能加速蚋类研究进展。对S. asakoae种团中某些黑蝇物种流行的多种病原体的分子检测，强调了在泰国及其他国家对这些医学和兽医学重要媒介进行持续流行病学监测的必要性。