《Diagnostic Microbiology and Infectious Disease》：Evaluation of Two Commercial Human Adenovirus Typing Kits in Children with Acute Respiratory Tract Infection
编辑推荐：
摘要本研究评估了两种商用人类腺病毒分型试剂盒在患有急性呼吸道感染儿科患者中的应用效果。2023年3月至12月期间，收集了呼吸道标本，使用多重实时定量聚合酶链反应试剂盒进行HAdV检测。以基于序列的HAdV分型作为参考方法，分别评估了一种基于毛细管电泳的多重PCR分型试剂盒（HEA
摘要
本研究评估了两种商用人类腺病毒分型试剂盒在患有急性呼吸道感染儿科患者中的应用效果。2023年3月至12月期间，收集了呼吸道标本，使用多重实时定量聚合酶链反应试剂盒进行HAdV检测。以基于序列的HAdV分型作为参考方法，分别评估了一种基于毛细管电泳的多重PCR分型试剂盒（HEALTH）对12种HAdV类型的检测性能，以及一种qPCR分型试剂盒（Uninovo）对7种HAdV类型的检测性能。在通过M-qPCR检测出HAdV阳性的267份样本中，基于序列的分型方法有215份呈阳性（80.5%，215/267），HAdV-CEMP（HEALTH）方法也有216份呈阳性（80.9%，216/267），而HAdV-qPCR（Uninovo）方法仅有125份呈阳性（46.8%，125/267）。尽管这两种试剂盒在HAdV-B3分型方面的一致性较好，Kappa值大于0.95，但新出现的重组型P7H3F3却被这两种试剂盒误判为B3型或判定为阴性。那些循环阈值较高的样本，在HAdV-CEMP（HEALTH）方法中被判定为HAdV-C2型和HAdV-C5型，但在基于序列的分型方法中则呈阴性。同时，通过基于序列的分型方法识别出的HAdV-C89 [Px2/H2/F2]、HAdV-C108 [Px1ps1/H2/F2]、Px1ps3H5F5和Px2H5F5等重组型病毒，也被HAdV-CEMP（HEALTH）方法误判为HAdV-C2型和HAdV-C5型。综上所述，HAdV-CEMP（HEALTH）试剂盒能够覆盖多种HAdV类型，且对C型病毒的检测灵敏度较高；而HAdV-qPCR（Uninovo）试剂盒则能可靠地检测出HAdV-B3型。不过这两种试剂盒都无法识别重组型病毒。
引言
人类腺病毒是一种无包膜的双链DNA病毒，其基因组长度为34-36 kb，包含三种主要的衣壳蛋白：五聚体基部、六聚体和纤维蛋白[1]。迄今为止，已发现116种人类腺病毒，它们被分为7个属（A-G）。为了解析人类腺病毒所引发的疾病多样性及其严重程度，以及这类病毒的流行情况，首先需要确定其所属的属或类型[2]。例如，B属中的3型和7型分别被命名为HAdV-B3和HAdV-B7，中国的一些研究显示，这两种病毒是北京地区住院儿童急性呼吸道感染中最常见的病毒类型，其中HAdV-B7引发的肺炎比HAdV-B3更为严重[3,4]。因此，准确地对人类腺病毒进行分型对于临床治疗和疫情监测至关重要。
此前，人类腺病毒的1-51型是通过血清中和试验和血凝抑制试验，并利用针对特定类型的血清来确定的，这些方法不仅耗时而且技术要求较高[5,6]。G属中唯一的52型则是首个通过全基因组测序而非传统血清学方法鉴定出的新类型[7]。此后，53–116型则是通过全基因组测序和系统发育分析确定的基因型，这些基因型是由种内或种间重组产生的，其中五聚体基部、六聚体或纤维蛋白基因是主要的重组热点区域[8]。人类腺病毒工作组建议，人类腺病毒的分型应基于全基因组序列或五种主要衣壳蛋白的基因序列[9]。虽然测序方法能够为发现新的重组病毒提供高度精确且强大的工具，但它需要专业的知识与资源支持[10]。因此，临床上亟需一种更为便捷的分型方法。
目前，已有几种商用分子人类腺病毒分型试剂盒问世，它们被视为能够快速、便捷地进行病毒分型的有效替代方案。然而，目前尚缺乏针对这些试剂盒在临床样本中检测性能的独立评估，这限制了它们在临床实验室中的广泛应用。因此，本研究选择基于序列的HAdV分型方法作为参考标准，利用患有人类腺病毒相关急性呼吸道感染的儿童的临床样本，对两种商用人类腺病毒分型试剂盒的性能进行了评估。
章节要点
临床样本
2023年3月至12月期间，从前往首都医科大学儿童健康中心的患有急性呼吸道感染的儿科患者身上采集了咽拭子样本，这些样本随后被置于2.5毫升的病毒转运培养基中（北京耀康生物技术有限公司提供），并在500×g的条件下离心10分钟。上清液的一部分被用于核酸提取，剩余部分则被保存在-80°C环境中。
核酸提取
使用QIAamp MinElute试剂从每份样本的140微升样本中提取总核酸。
HAdV检测
通过M-qPCR检测，共有267份样本呈HAdV阳性。在基于序列的HAdV分型中，有52份样本未检测到PCR产物，被判定为HAdV阴性；而有215份样本被判定为HAdV阳性，其中66份样本仅有一两种基因序列，149份样本则拥有完整的五聚体基部、六聚体和纤维蛋白基因序列，阳性率为80.5%（215/267）。在HAdV-CEMP（HEALTH）方法中，有216份样本出现了预期的大小条带，被判定为HAdV阳性。至于HAdV-qPCR方法……
讨论
由于操作简单且性能稳定，商用PCR试剂盒已被广泛用于各类病毒病原体的检测[16]。目前市面上有一些可用于HAdV检测的商用试剂盒，比如RealStar?腺病毒PCR试剂盒（Altona Diagnostics公司出品）、Adenovirus R-Gene?试剂盒（bioMérieux公司出品）以及ELITe MGB?试剂盒，但这些试剂盒均无法用于HAdV的分型工作[10,17,18]。由于不同类型的HAdV在致病性方面存在显著差异，因此准确对其进行分型具有重要意义。
资金支持
本研究得到了北京市健康改善与研究基金（项目编号：shoufa-2022-1G-1131和shoufa 2022-4G-1133）、北京市卫生健康委员会高层次技术人才建设项目（项目编号：Discipline Leader-02-20）、北京市医学科研机构公益发展改革试点项目（项目编号：JYY2023-10），以及儿童呼吸道感染病原体谱系与宿主标志物分析项目（项目编号：2024-0040）的支持。
伦理审批
本研究已经获得了首都儿科研究所伦理委员会的批准，审批编号为SHERLL2022015。
作者贡献
CDM和GYN负责开展分子实验并撰写文章初稿；GYN和DR负责生物信息学分析及统计分析工作；LLY、ZRN、SY、JLP、ZYT、GQ、YY为研究提供了技术支持和物质帮助；MXL和ZCM则提供了临床样本及相关数据；ZLQ负责研究的构思与设计，同时还参与了文章的审阅与修改工作。所有作者都阅读并认可了最终版的论文内容。
CRediT作者贡献说明
陈东梅：正式分析、数据整理。郭一楠：文章初稿撰写、数据整理。戴瑞：正式分析。刘丽颖：资源提供。朱润楠：资源提供。孙宇：资源提供。贾立平：资源提供。周雨彤：资源提供。郭琪：资源提供。姚瑶：资源提供。马晓林：研究调查工作。朱春梅：研究调查、概念设计。赵琳青：文章审阅与编辑、研究监督、概念设计。
Dongmei Chen|Yinan Guo|Ri De|Liying Liu|Runan Zhu|Yu Sun|Liping Jia|Yutong Zhou|Qi Guo|Yao Yao|Xiaolin Ma|Chunmei Zhu|Linqing Zhao
