《Diagnostic Microbiology and Infectious Disease》：Validation of a nested PCR OmpB-RFLP for identification of Rickettsia species found in Colombia
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•用于检测立克次体属物种的标准化嵌套PCR–RFLP检测方法。•针对ompB基因设计的新引物提升了扩增灵敏度。•检测限可达每微升一份ompB基因拷贝。•可通过一种AluI限制性内切酶实现物种区分。•该方法是经济高效的，适用于在哥伦比亚开展立克次体病监测工作。引言立克次体病是一类由
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用于检测立克次体属物种的标准化嵌套PCR–RFLP检测方法。
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针对ompB基因设计的新引物提升了扩增灵敏度。
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检测限可达每微升一份ompB基因拷贝。
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可通过一种AluI限制性内切酶实现物种区分。
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该方法是经济高效的，适用于在哥伦比亚开展立克次体病监测工作。
引言
立克次体病是一类由属于立克次体属的专性细胞内革兰氏阴性细菌引起的新出现或再次出现的动物源性疾病。这类病原体通过硬蜱、跳蚤、虱子及螨虫等吸血节肢动物传播，其中硬蜱（属于Ixodidae科）是这类细菌的主要传播媒介[1]。立克次体属物种在系统发育上可划分为四大类：(i)斑疹热群，包含20多种已知物种，均与蜱虫相关，其中一些是人类的重要病原体，如立克次体立克次氏体、立克次体康诺里氏体、立克次体帕克里氏体等；(ii)斑疹伤寒群，仅有两种物种，即普罗瓦泽克立克次体和斑疹伤寒立克次体，它们分别通过虱子和跳蚤传播给人类；(iii)过渡群，主要包括与蜱虫（立克次体澳大利亚种）、螨虫（立克次体阿卡里种）或跳蚤（立克次体猫种）相关的人类病原体；(iv)祖先群，包含几种与蜱虫相关的微生物，如立克次体贝利种、立克次体加拿大种，但目前尚未确认它们是人类或动物的病原体[2]。
斑疹热群对公共卫生而言最为重要，因为它包含了大多数已知且毒性较强的物种，比如立克次体立克次氏体、立克次体康诺里氏体、立克次体马西利亚种以及立克次体帕克里氏体[3,4]。在美洲，由于立克次体立克次氏体的高毒性和致死性，它是研究最多的物种，也是落基山斑疹热の致病菌[2,5]。
在哥伦比亚，不同气候条件下的多个省份都出现过立克次体病暴发和病例，这些省份包括昆迪纳马卡省、安蒂奥基亚省、卡尔达斯省以及科尔多瓦省[[6], [7], [8], [9]]。此外，针对发热患者开展的多项血清流行病学研究显示，感染率超过40%，这说明当地人群普遍存在接触蜱传病原体的风险[8,10,11]。除了立克次体立克次氏体之外，哥伦比亚还检测到了其他物种，包括哥伦比亚立克次体候选种、立克次体贝利种、大西洋雨林株立克次体帕克里氏体、立克次体安布利奥马蒂斯种、立克次体阿森博尼恩西斯种、立克次体猫种以及斑疹伤寒立克次体等[[12], [13], [14], [15]]。
尽管在哥伦比亚开展的诸多研究都证实了立克次体作为发热综合征致病菌的重要性，但需要指出的是，立克次体病在哥伦比亚的卫生体系中并不属于需报告的疾病。此外，现有的诊断技术存在不足，导致人们低估了该疾病在该国的危害程度。因此，立克次体病往往无法被及时发现，且在与其他常见发热性疾病如登革热、钩端螺旋体病、疟疾、黄热病、基孔肯雅热以及寨卡病毒感染等的鉴别诊断中常常被忽视[8]。在哥伦比亚，人类立克次体病的诊断通常采用间接免疫荧光试验和细胞培养分离法，但这些方法存在诸多局限，比如抗原供应不足、需要较高的生物安全级别以及需要专业技术人员操作等[16,17]。
聚合酶链反应这类分子检测方法因能利用多种目标基因而成为有效的诊断工具。其中，表面细胞抗原家族中的sca0、sca1、sca2、sca4和sca5基因尤为重要。sca0基因（也称为ompA）和sca5基因（称为ompB）常被用来确定病原体所属的群和种[16,18]。ompB基因存在于斑疹热群、过渡群和斑疹伤寒群中，而ompA基因仅存在于斑疹热群的物种中。除此之外，编码柠檬酸合酶的gltA基因、编码表面蛋白的htrA基因以及编码16S核糖体RNA的rrs基因也被用作检测靶标[16,17]。尽管PCR在诊断中很有用，但许多检测策略仅能实现属级鉴定。若要确定种级，就需要对上述部分分子靶标进行DNA测序，并将结果与GenBank中的参考序列进行比对。这种方法不仅能显著提高诊断准确性，还能缩短获取结果的时长[16,19]。
除了测序技术外，还可以使用特定的杂交技术，但这些技术需要多种探针，比如反向线印迹法，这就限制了它们的广泛应用。与这种技术类似，PCR结合限制性内切酶的方法，也就是PCR-RFLP技术（PCR产物的限制性片段长度多态性分析），也被广泛应用。该方法能够生成每种立克次体物种特有的条带模式[[20], [21], [22]]。PCR-RFLP技术成本较低，是一种经济高效的基因分型方法。与核苷酸测序相比，它能在更短的时间内、以更低的成本区分不同的立克次体物种，为此也催生了新的诊断方法的出现。
哥伦比亚境内存在多种立克次体物种，包括立克次体立克次氏体、哥伦比亚立克次体候选种、立克次体猫种、立克次体安布利奥马蒂斯种以及立克次体帕克里氏体等，这凸显了该国立克次体流行病学的复杂性。这种多样性使得迫切需要开发、标准化并验证既经济高效又便于使用的分子初步诊断和辅助诊断测试。这类诊断工具对于准确检测、识别病原体种类以及判断立克次体感染的严重程度至关重要，进而有助于提升疾病监测水平和临床诊疗效果。基于以上原因，本研究的目的是为哥伦比亚最常见的立克次体物种建立并验证基于PCR-RFLP的诊断及物种鉴定系统。
章节要点
研究设计与样本采集
本研究使用来自哥伦比亚已报道的各种立克次体物种的DNA，对一种初步检测方法进行了实验性分析验证。立克次体立克次氏体、立克次体帕克里氏体、立克次体安布利奥马蒂斯种以及斑疹伤寒立克次体 的DNA样本是通过DNeasy Blood and Tissue Kit（Qiagen TM，美国日耳曼敦公司）提取的，这些样本由美国加尔维斯顿德克萨斯大学医学分校的David H. Walker博士提供。立克次体阿森博尼恩西斯种和立克次体猫种的DNA则由Pontificia大学的Marilyn Hidalgo博士提供
基因分型
通过实验进行的消化处理产生了各物种特有的条带模式，这些条带的长度大约在50到504碱基对之间，与SnapGene?软件预测的谱型一致（见图1）。不过，由于消化产物中存在低分子量条带，且这些条带在琼脂糖凝胶上难以分离和观察，因此只有分子量大于或等于100碱基对的条带才会被纳入各物种的谱型判定标准。需要强调的是
讨论
分子诊断技术已被公认为检测立克次体病原体的敏感、快速且特异的工具[16,17,28]。在这类诊断方法中常用的基因里，ompB基因（即Sca5基因）因有大量可用的序列数据而备受关注。ompB基因在细菌的致病过程中起着关键作用，尤其体现在它帮助细菌附着并侵入宿主细胞方面。它同时也是引发机体免疫反应的主要抗原决定簇之一
资金支持
本研究最初是由安蒂奥基亚大学研究发展委员会授予的“作为人类潜在传播区域中立克次体传播监测对象的马匹”项目提供的资金支持的，项目编号为2014-321。后来，我们还获得了编号为2020-34110的项目的部分资助，该项目的名称为“
CRediT作者贡献说明
Marcela Gómez Gómez：论文撰写——初稿撰写、方法学研究、实验开展、数据分析、数据整理、概念构建。 Carolina Montoya-Ruiz：论文撰写——审阅与编辑、初稿撰写。 Juan Camilo Pérez-Pérez：实验开展、数据分析、概念构建。 Leidy Y Acevedo-Gutiérrez：监督工作、实验开展、数据分析。 Juan David Rodas：论文撰写——审阅与编辑、监督工作、项目管理工作、方法学研究、实验开展、资金筹集、数据分析，
Marcela Gómez Gómez|Carolina Montoya-Ruiz|Juan Camilo Pérez-Pérez|Leidy Y Acevedo-Gutiérrez|Juan David Rodas
