一种生物素功能化的近红外荧光探针，用于追踪肿瘤中的羧酸酯酶及其治疗过程

《Dyes and Pigments》：A biotin-functionalized near-infrared fluorescent probe for tracking carboxylesterase in the tumor and its therapeutic process

　　

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  用于检测CEs的探针CY-3在740纳米处具有强烈的近红外发射特性。
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  CY-3可通过生物素精准定位HCC细胞及异种移植肿瘤。
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  CY-3能够追踪病理过程及治疗过程中CEs的动态变化。

引言

羧酸酯酶（CEs）是参与脂质代谢和药物解毒的关键丝氨酸水解酶[1]、[2]。在细胞增殖早期、炎症应激、缺氧微环境以及治疗引发的代谢重编程过程中，CEs的活性会呈现动态变化，且其活性与多种肿瘤状态密切相关。例如，在晚期肝细胞癌中，CEs的表达显著降低，这一现象被视为肿瘤去分化及不良临床预后的重要标志。CEs在胃肠道恶性肿瘤中高度富集，其特定的表达水平决定了抗癌前药的局部激活效率。在乳腺癌和肺癌中，CEs的异常上调常被用作靶向前药治疗的代谢脆弱点。显然，CEs活性的动态变化会深刻影响癌症的进展和药物耐药性[3]、[4]、[5]。因此，监测肿瘤细胞中CEs的动态变化对于了解肿瘤的发生、发展及治疗具有重要意义。

目前检测CEs的方法主要包括高效液相色谱法（HPLC）[6]、[7]、酶联免疫吸附试验（ELISA）[8]以及比色分析法，但这些方法通常存在操作繁琐、样本预处理复杂以及取样具有破坏性等缺点[9]、[10]。近年来，由于具有高灵敏度、操作简单以及可实时成像的优点，荧光探针技术已成为检测如CEs这类生物标志物的重要工具[11]、[12]、[13]、[14]、[15]。例如，基于苯并噁唑-半花青素的MOR-CES2探针，其检测限低至0.3纳克/毫升，能够实现甲状腺癌和炎症性肠病小鼠模型中病变部位的高信噪比成像[16]。基于二氰基异佛尔酮的DCI-Gal-Bz探针具有肝脏靶向能力，响应时间仅为10分钟，对CEs的检测限为0.235单位/毫升，可用于观察DILI小鼠模型中CEs的动态变化[17]。基于半花青素的HP-LZ-CES2探针同样具备肝脏靶向能力，其斯托克斯位移为185纳米，选择性高，检测限低至0.0086微克/毫升，有助于在鼠类非酒精性脂肪肝病模型中实现对CES2的有效成像，精准展现该模型中组织特异性的CES2变化[18]。在针对细胞器层面的定位方面，基于阳离子吲哚鎓的DBF-CES2探针的斯托克斯位移为167纳米，检测限为0.70纳克/毫升，能够成功区分小鼠模型中的结肠炎与结直肠癌[19]。基于胆酸结合罗丹明のLDM-CA探针则具有肝细胞线粒体靶向能力，选择性高，对CEs的检测限为2.22×10^-2单位/毫升，可在小鼠体内实现皮下肝细胞癌的成像，并为手术提供精准指导[20]。基于2-(2-羟基苯基)苯并噻唑骨架的HBT-CE探针的荧光强度可提升52倍，检测限低至4.02×10^-5单位/毫升。其高灵敏度使得能够在活体癌细胞、斑马鱼及裸鼠模型中实现对药物诱导的CEs调控过程的动态监测[21]。基于菲伦酮骨架的Benz-AP探针具有比率荧光响应特性，最大双光子截面为24吉米，这种诊疗一体化探针能够实现对伊立替康耐药肿瘤球体中hCES2活性的实时监测，并开展针对性光动力治疗[22]。基于二氰亚甲基-4H-吡喃骨架的DCM-CES2探针检测限低至0.087微克/毫升，最大双光子截面为26吉米，这种近红外探针能够在原位结肠癌小鼠模型中，检测到抗癌前药激活过程中CEs2活性的动态变化[23]。然而，目前大多数已报道的用于检测CEs的荧光探针要么缺乏肿瘤靶向能力，要么发出的荧光难以穿透生物组织，这导致难以区分肿瘤组织与正常组织中的CEs，也无法实时追踪肿瘤内部CEs的动态变化，从而极大限制了它们在肝细胞癌精准诊断和治疗中的应用[24]、[25]、[26]、[27]。

众所周知，生物素受体即钠依赖性多维生素转运蛋白（SMVT），在各种恶性肿瘤中过度表达，有助于肿瘤快速摄取营养物质以促进其生长发展[28]、[29]、[30]。经生物素修饰的化合物能够特异性识别生物素受体，通过受体介导的内吞作用进入肿瘤细胞，从而展现出良好的肿瘤靶向效果。在本研究中，研究人员设计并合成了一种用于检测CEs的近红外荧光探针CY-3（见图1B），其中选择长链共轭苯并噻唑半花青素作为近红外荧光基团，苯甲酸作为识别CEs的基团[31]、[32]、[33]、[34]，而生物素则被用作肿瘤靶向基团[35]、[36]、[37]、[38]。随后，研究人员进一步研究了CY-3的光谱特性、其在活体细胞及携带肿瘤的小鼠体内监测CEs的能力，以及其在伊马替尼治疗过程中的肿瘤靶向潜力与治疗监测功能。这项研究为肝癌的早期诊断和精准治疗提供了一种新的可视化工具。

章节要点

材料与设备

所有化学试剂均直接使用，无需额外纯化。¹H/¹³C核磁共振谱及高分辨率质谱数据是在美国布鲁克公司的AV600和Impact II Q-TOF-MS仪器上获取的。紫外-可见吸收光谱和荧光光谱则分别通过日本岛津公司的UV-2700光谱仪和日立公司的F-4700光谱仪测定。细胞及分离器官的成像则是利用日本奥林巴斯公司的FV3000激光共聚焦显微镜和德国徕卡公司的TCS-SP8MPT显微镜完成的。密度泛函理论

CY-3的合成

如图1C所示，2,4-二羟基苯甲醛与3,4-二氢-2H-吡喃在酸催化作用下发生亲核加成反应，生成化合物1（产率：76%）。在碱性条件下，化合物1与化合物2会发生串联亲核取代反应及分子内缩合反应，进而生成化合物3（产率：34%）。之后，使用对甲苯磺酸吡啶盐进行脱保护处理，得到化合物4（产率：66%），该化合物随后会与

结论

在本研究中，研究人员设计并合成了一种经生物素修饰的近红外肿瘤靶向荧光探针CY-3。CY-3对CEs具有极高的灵敏度，其检测限低至4.04×10^-3单位/毫升，同时还能有效排除Ly、PL、GOX、CT、Et、BSA、Glu、Tyr、GSH、Try、Asp、Leu、Arg、Gln、Ala、Trp、Phe、Gly、Glc、Cu²⁺、Pb²⁺、Na⁺、Fe²⁺、HPO₄^2-、SO₄^2-、HS^-、H₂O₂、TBHP以及V_C等物质的干扰。值得注意的是，CY-3能够特异性区分肝细胞癌HepG2细胞与

作者贡献说明

王一平：正式分析、数据整理。岑毅：初稿撰写、正式分析、数据整理。易庆远：正式分析。王绵：项目监督、项目管理。梁丽欣：数据整理。袁张利：项目监督、项目管理。王建义：审稿与编辑、项目监督、项目管理

利益冲突声明

作者声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了广西自然科学基金（编号：2024GXNSFAA010175）、国家自然科学基金（编号：22267002）、广西医科大学第二附属医院科研基金（编号：GJPY2023002）、国家中医药管理局中药质量监控评价重点实验室开放课题（编号：KFKT2022-3）以及广西研究生教育创新项目（编号：YCBZ2023031）的支持。

岑毅|王一平|易庆远|梁丽欣|王绵|王建义|袁张利