关于与稻草相关的细菌Klebsiella quasipneumoniae A5(2)的木聚糖和纤维素利用潜力的全基因组分析

《Ecological Genetics and Genomics》：Whole-genome insights into Xylan- and Cellulose-utilization potential of Klebsiella quasipneumoniae A5(2), a rice straw-associated bacterium

　　摘要
稻草是一种大量的木质纤维素类农业废弃物，其不当处理方式，如露天焚烧，会造成环境污染。作为一种可持续的替代方案，通过微生物降解稻草可为这类废弃物的处理提供环保策略。本研究中，从稻草中分离出一种与之相关的细菌——假肺炎克雷伯菌A5(2)，并利用全基因组测序和生化检测对其进行了分析，同时通过重量损失分析以及扫描电子显微镜观察来评估其功能潜力。该菌株为革兰氏阴性杆状菌，具有过氧化氢酶、脲酶、柠檬酸利用能力以及伏格斯-普罗斯考尔试验（乙酰醇生成）阳性反应，其16S rRNA基因序列与肺炎克雷伯菌的相似度达99.23%。初步酶活性检测显示，该菌的羧甲基纤维素酶活性为0.0414 U/mL，木聚糖酶活性为9.643 U/mL。重量损失分析表明，在7天培养后，稻草的降解率为10.02%。该菌的全基因组序列长度为5.04 Mb，GC含量为58.2%，完整性为96%，其中包含内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖1,4-β-木糖苷酶等碳水化合物活性酶，以及针对半纤维素底物的辅助酶，但缺乏外切葡聚糖酶和传统的内切木聚糖酶基因，这表明它能部分利用木聚糖并水解纤维素。总体而言，本研究从全基因组层面揭示了假肺炎克雷伯菌A5(2)在利用木聚糖和纤维素方面的潜力及其在生态系统中的作用，强调了它在参与碳循环和维持农业生态系统稳定性的稻草降解微生物群落中的重要作用。

引言
稻草是水稻种植过程中的副产品，水稻收割后仍会留下大量此类废弃物[1]。稻草是木质纤维素生物质中最丰富的来源之一，其主要成分包括木质素（15-20%）、半纤维素（20-25%）和纤维素（30-45%），这些成分共同构成了结构极为复杂的体系[2]。正是由于这种复杂的结构，稻草难以自然分解[3]。通常需要3年时间才能使其分解约77%[4]。如此漫长的分解时间给农民准备下一季耕作土地带来了困难，因此露天焚烧成为农民常用的处理方式[5]。然而，这种做法会加剧环境恶化，向空气中释放二氧化碳、一氧化碳、氮氧化物、二氧化硫等污染物，不仅降低空气质量，还会推动全球变暖进程[6][7]。此外，露天焚烧还会使土壤表面温度升高，从而导致有益微生物数量减少、土壤肥力下降[8]。因此，迫切需要可持续且环保的替代方法来处理农业废弃物。

通过微生物生物转化处理稻草，可为农业废弃物管理提供可持续的解决方案。借助微生物降解作用，稻草可被转化为生物肥料、生物燃料等高附加值产品，从而助力可持续农业发展[9]。微生物通过分泌纤维素酶、半纤维素酶和木质素酶，共同分解稻草中复杂的木质纤维素结构[10][11][12]。目前已有多种细菌和真菌菌株，如枯草芽孢杆菌、溶蛋白芽孢杆菌、拟副梭菌、青霉菌以及平菇，被证实具有产生木质纤维素降解酶的能力[13][14][15]。值得注意的是，越来越多的研究指出，微生物群落往往比单一菌株更具降解效率。由曲霉、芽孢杆菌、根霉菌、假单胞菌、镰刀菌和木霉等真菌与细菌组成的混合群落能够协同发挥作用[16]。在这些微生物群落中，各成员各自具备互补的酶活性，共同加速半纤维素、纤维素和木质素的降解。这种协同作用体现了自然分解者群体中常见的生态协作现象。尽管已有诸多研究成果，但仍有许多新的微生物菌株有待发现和评估，尤其是在处理稻草方面。通过对细菌分离株进行基因组解析，可以识别出各类碳水化合物活性酶家族[17]。这种方法还有助于筛选出能够利用稻草生物质的微生物候选株，并帮助了解微生物适应植物残体环境的遗传机制[11][18]。

在此背景下，寻找具有未被探索的代谢潜能的新细菌候选株，对于丰富可用于分解稻草各组分的微生物资源至关重要。与枯草芽孢杆菌属和木霉属等已广为人知的、因其强大的胞外酶系统而被视为主要降解菌的木质纤维素降解微生物不同，肺炎克雷伯菌传统上并不被视为关键的木质纤维素降解菌。不过，它具备多种代谢功能，且能定植于多种环境和与植物相关的生境中，这表明它可能在木质纤维素生态系统中占据某种互补的生态位[19][20]。稻草所处的环境具有底物种类多样、养分供应不稳定等特点，因此需要能够在这种复杂的植物相关微生物群落中存活的微生物。在这样的环境中，环境适应性强的肺炎克雷伯菌菌株可能具有竞争优势，从而在其参与的稻草降解系统中发挥补充作用。先前的研究已经证明了肺炎克雷伯菌的环境重要性。有研究表明，该菌具有降解外来物质的能力，这暗示其在生物修复中的作用[19]。此外，肺炎克雷伯菌GT7在高盐条件下仍能降解偶氮染料，表明它在恶劣环境中也具有去除污染物的潜力[21]。它在可持续农业中的作用也已被认可，与氮基肥料结合使用可提高作物产量和土壤肥力[20]。另外，一项计算机模拟研究还发现了肺炎克雷伯菌基因组中若干与植物相关的基因，如kpk_4954和kpk_2333（过氧化氢酶基因）、hecA（血凝素分泌蛋白）以及nifJ–nifQ（固氮基因簇），这些都体现了该菌适应植物相关生境的能力[22]。此外，对变异克雷伯菌HSTU-AAM51菌株的基因组分析也显示，该菌含有多种碳水化合物活性酶以及潜在的木质纤维素降解途径[23]。这些发现表明，某些克雷伯菌属物种可能在自然环境中参与植物生物质的分解。鉴于肺炎克雷伯菌具备这些与环境相关的功能，它有望成为处理稻草等农业废弃物的候选菌种。不过，其在木质纤维素生物质利用方面的作用，尤其是在稻草相关环境中的功能，目前仍缺乏充分研究。

本研究旨在分离并鉴定一种与稻草相关的细菌——假肺炎克雷伯菌A5(2)，并探究其在利用稻草组分方面的基因组及功能潜力。我们通过全基因组分析、生化检测和初步酶活性筛查、重量损失分析以及扫描电子显微镜观察等方法，评估了该菌利用木聚糖和纤维素的潜力，同时分析了其与稻草环境相适应的遗传基础。据我们所知，这是首项同时从表型特征和全基因组角度验证稻草相关肺炎克雷伯菌菌株木聚糖和纤维素利用潜力的研究。这一综合分析结果揭示了该菌株在稻草分解过程中的生态重要性。总体而言，这些研究结果有助于深入了解假肺炎克雷伯菌A5(2)的功能基因组特性，凸显了它在参与碳循环和维持农业生态系统可持续性的稻草降解微生物群落中所可能扮演的辅助角色。

样本采集
稻草样本采集自马来西亚吉打州的三个不同地点：彭当（北纬5°59'14.68”，东经100°27'52.87”）、托凯（北纬6°01'25.33”，东经100°24'33.78”）以及布基拉亚（北纬6°01'13.76”，东经100°25'37.14”）。采样后，样本被储存在4℃环境中，以保留其中的原生细菌，便于后续分离。

细菌分离与筛选
按照改良后的实验方案从稻草中分离细菌[24]。简而言之，将1克稻草悬浮在15毫升无菌的0.07 M磷酸钾缓冲液（pH值为7.2）中，然后搅拌均匀。

生理与酶活性特征分析
从稻田中采集的稻草样本中成功分离出了假肺炎克雷伯菌A5(2)（见补充图1）。该菌株表现出明显的纤维素降解能力，用碘液染色后在CMC琼脂上形成了透明圈。形态学分析显示，假肺炎克雷伯菌A5(2)为革兰氏阴性杆状菌（见补充图2）。为了进一步了解其生理和代谢特性，还进行了系列生化测试。

讨论
稻草是水稻种植过程中产生的大量木质纤维素类废弃物，在农业地区随处可见，但目前利用率仍然较低。这类废弃物中有很大一部分被露天焚烧，不仅造成空气污染、温室气体排放，还会降低土壤肥力[50]。通过微生物降解稻草，可以为这种破坏性处理方式提供更环保的替代方案。多项研究表明，有多种微生物参与了稻草的降解过程。

结论
本研究通过生化、基因组学以及初步功能分析，成功分离并鉴定了与稻草相关的细菌——假肺炎克雷伯菌A5(2)。研究结果表明，该菌株具备部分利用木聚糖和纤维素的遗传和生理能力。由于缺乏外切葡聚糖酶以及传统的内切木聚糖酶（GH10/GH11）基因，该菌株不太可能作为主要的木质纤维素降解菌，而更可能发挥其他作用。

作者贡献声明
Kazi Sneha Chhando：撰写原始稿件、方法设计、正式分析、数据整理、概念构思。
Pui Teng Tang：方法设计。
S. M. Istiaque Hamim：图像可视化、正式分析。
Hajar Fauzan Ahmad：撰写审阅稿与编辑稿、结果验证、概念构思。
Lik Yang Ooi：方法设计。
Jia Jie Chew：方法设计。
Chin Mei Lee：撰写审阅稿与编辑稿、结果验证、项目监督、资金申请、数据整理、概念构思。

利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

数据可用性
如需获取数据，可随时提出请求。

关于写作过程中生成式人工智能及人工智能辅助技术的声明
在撰写本文时，作者仅使用了ChatGPT来优化手稿的语言表达。在使用该工具后，作者对内容进行了必要的审核和修改，并对最终发表的内容承担全部责任。

资金支持
本研究得到了马来西亚高等教育部基础研究资助计划FRGS/1/2022/WAB04/UMP/02/1以及马来西亚彭亨苏丹阿卜杜拉大学的基础研究资助RDU210338的支持。

利益冲突声明
? 作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢
作者衷心感谢马来西亚高等教育部通过基础研究资助计划FRGS/1/2022/WAB04/UMP/02/1提供的资金支持，同时也感谢马来西亚彭亨苏丹阿卜杜拉大学通过基础研究资助RDU210338给予的资助。此外，我们还要感谢来自马来西亚吉打州彭当、托凯和布基拉亚的农民们所提供的稻草样本。

Kazi Sneha Chhando | Hajar Fauzan Ahmad | Lik Yang Ooi | Pui Teng Tang | S.M. Istiaque Hamim | Jia Jie Chew | Chin Mei Lee
马来西亚彭亨苏丹阿卜杜拉大学工业科学与技术学院，马来西亚彭亨州关丹市Tun Khalil Yaakob大道26300号