《European Journal of Pharmaceutical Sciences》：Localized In-Situ Nanomedicine Synthesis Enables Copper-Mediated Cuproptosis for Effective Bladder Cancer Therapy
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基于纳米药物的方法通过实现局部递送、改善组织滞留以及微环境响应的治疗性激活，为癌症治疗提供了新的前景。由于高复发率以及传统膀胱内灌注疗法的有效性受限，膀胱癌仍然是一项具有挑战性的难题，这主要归因于组织渗透性不足和药物滞留时间短，尤其是在尿液冲刷（排尿）条件下。
基于纳米药物的方法通过实现局部递送、改善组织滞留以及微环境响应的治疗性激活，为癌症治疗提供了新的前景。由于高复发率以及传统膀胱内灌注疗法的有效性受限，膀胱癌仍然是一项具有挑战性的难题，这主要归因于组织渗透性不足和药物滞留时间短，尤其是在尿液冲刷（排尿）条件下。本研究旨在开发一种局部给药的纳米药物平台，该平台利用膀胱的解剖和生化特征来增强治疗效果。研究人员开发了一种在膀胱腔内通过金属辅助快速聚合原位合成的铜整合聚多巴胺基纳米药物（uDHC）系统。所得纳米药物对膀胱黏膜表现出强黏附性，从而实现延长滞留。尿酶的掺入允许利用尿液中存在的内源性尿素，生成局部理化梯度，增强纳米药物向肿瘤组织中的渗透。持续释放的铜离子通过调节关键的线粒体代谢调节因子，破坏了线粒体铜稳态并诱导铜死亡（cuproptosis）。同时，聚多巴胺基质能够实现高效的近红外光热转换，放大肿瘤细胞损伤并促进免疫原性细胞死亡（ICD）。体外研究表明，该纳米药物对膀胱癌细胞具有细胞毒性，而对正常尿路上皮细胞影响极小。在原位膀胱癌小鼠模型中，膀胱内灌注该纳米药物系统显著抑制了肿瘤生长，尤其是在结合近红外照射时。总体而言，这一多功能纳米药物平台整合了局部递送、微环境响应性激活、增强的组织渗透性，以及协同的铜死亡和光热效应，解决了当前膀胱内灌注疗法的关键局限性，并支持了原位合成纳米药物用于局部膀胱癌治疗的转化潜力。
膀胱癌（BLCA）由于高复发倾向及常规疗法（常伴随侵入性操作、系统性毒性）的局限性，在临床治疗中构成严峻挑战。特别是针对早期和非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）的标准治疗模式，常受到肿瘤耐药性、不良反应及肿瘤清除不完全的阻碍。常规纳米药物面临复杂多步合成、批次差异和过早清除等转化瓶颈，而在外部环境中合成的药物常因过度纯化而降低生物活性。膀胱独特的解剖结构（封闭腔体、坚固的尿路上皮屏障）及其尿液介导的生化微环境，为通过膀胱内灌注进行原位纳米药物合成提供了理想场所。为此，研究人员开发了负载尿酶的铜整合聚多巴胺纳米药物（uDHC）系统。该系统利用铜离子加速多巴胺的原位聚合，结合尿酶驱动的主动运动增强渗透，通过铜介导的细胞死亡（cuproptosis，一种依赖于铜离子的非凋亡性调节细胞死亡途径）与近红外二区（NIR-II）光热治疗（PTT）的协同作用，实现了高效的肿瘤清除。该研究发表在《European Journal of Pharmaceutical Sciences》，为克服当前膀胱内灌注药物滞留短和渗透差的局限性提供了新的转化策略。
研究人员主要采用了以下关键技术方法开展研究：利用金属铜离子辅助的快速聚合反应在模拟生理条件下一步法合成uDHC纳米药物；通过动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）表征其理化性质及酶驱动运动轨迹；使用紫外-可见光谱和红外热成像仪评估其在1064 nm激光下的光热转换效率；结合细胞活力测定、活死染色、琼脂糖划痕实验评估体外抗肿瘤活性；利用JC-1染色、蛋白质印迹法（Western blotting）和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析线粒体膜电位及铜死亡相关基因（LIAS、FDX1、DLAT）及免疫因子的表达变化；样本队列来源为7-8周龄的雌性C57BL/6小鼠，通过MB49-Luciferase细胞原位种植建立膀胱癌小鼠模型，并经由膀胱内灌注给药评估其体内滞留、抗肿瘤疗效及生物安全性。
合成与表征研究
通过在模拟膀胱生理条件（38°C，pH 6.5）下进行合成研究，发现uDHC表现出缓慢且可控的聚合特征，zeta电位保持在-23 mV至-26 mV之间，这有利于在膀胱内均匀分布并减少颗粒聚集。能谱（EDS）分析证实了碳（C）、氧（O）、氮（N）以及铜和镍元素在聚合物框架中的成功整合，为铜死亡和酶驱动运动提供了结构基础。释放动力学研究表明，DHC中的Cu离子释放随时间依赖性增加，在72小时内达到稳定状态，早期释放归因于基质在低pH和过渡金属存在下的降解。这些特征表明uDHC在生理条件下保持了结构完整性和多功能组成，高度适用于膀胱内治疗。
尿酶驱动的运动分析研究
通过在含不同浓度尿素的磷酸盐缓冲液（PBS）中观察uDHC的运动轨迹、均方位移（MSD）和有效扩散系数，研究人员发现uDHC的运动速度和距离与尿素浓度呈线性正相关。相比之下，未负载尿酶的DHC仅表现出极小的布朗运动。这证实了尿酶催化尿素水解产生的氨和二氧化碳可为纳米结构提供推进力，揭示其在生物医学应用中实现主动和高效渗透的潜力。
光热特性研究
紫外-可见光谱分析显示，uDHC和DHC在约1050 nm处具有近红外二区（NIR-II）的额外吸收峰。在1064 nm激光照射下，uDHC表现出显著的温度升高，且升温速度受纳米药物浓度和激光功率密度的正调控。通过记录加热和自然冷却曲线并计算时间常数，研究证实了该纳米药物作为深层组织光热治疗剂的可调控性与潜力。
抗肿瘤效力与细胞摄取研究
体外细胞实验表明，所有含铜纳米药物对MB49膀胱癌细胞均表现出浓度依赖的细胞毒性，uDHC和DHC的半抑制浓度（IC50）约为2.5 μg/mL。相比之下，单独的多巴胺（DA）和尿酶无明显影响。值得注意的是，DHC对正常的SV-HUC-1尿路上皮细胞毒性极小，显示出良好的治疗窗口和肿瘤特异性。活死细胞染色显示，结合近红外照射后，膀胱癌细胞的存活率显著降至11%至14%。通过共聚焦显微镜观察标记有Cy5..5的DHC被细胞内吞的过程，证实了其具有随时间逐渐增加的细胞内积累能力。
增强黏附与渗透的原位聚合研究
体外和体内黏附实验表明，通过原位聚合形成的纳米药物（uDHC和DHC）相较于预聚合颗粒，展现出显著增强的组织黏附稳定性和抵抗机械冲刷的能力。在小鼠膀胱内灌注72小时后，原位聚合的uDHC保持最高的荧光信号和滞留量。组织学评估证实，uDHC能够广泛覆盖膀胱黏膜并深入渗透至组织深层，这主要归功于尿酶介导的主动运输机制，极大改善了常规灌注药物难以到达深层肿瘤病灶的问题。
铜死亡/PTT相关损伤及通路激活研究
通过JC-1染色发现，DHC处理引起MB49细胞内线粒体膜电位（?Ψm）发生显著去极化。Western blotting分析证实，DHC和uDHC显著增加了二氢硫辛酰胺S-乙酰转移酶（DLAT）的聚集，同时下调了铁氧还蛋白-1（FDX1）和硫辛酸合成酶（LIAS）的表达，这是铜死亡的标志性分子特征。结合PTT后，热休克蛋白90（HSP90）表达显著升高，表明光热效应加剧了细胞应激。RT-qPCR数据显示，促凋亡基因（BAX）、免疫原性细胞死亡（ICD）标志物（HMGB1）及促炎因子（IL-6、TNF-α、IL-1β）显著上调，证实铜死亡诱导与PTT在引发抗肿瘤免疫和凋亡方面具有协同作用。
体内应用与疗效研究
在原位膀胱癌小鼠模型中，通过活体成像系统（IVIS）监测显示，uDHC联合激光治疗组几乎完全根除肿瘤，小鼠在整个30天观察期内全部存活，且体重保持稳定。对照组和DA组膀胱因严重肿瘤负荷显著增大且重量增加，而uDHC+L组的膀胱重量接近正常水平，平均仅37 mg。组织病理学检查显示，uDHC+L组保留了正常的膀胱壁结构，且uDHC有效缓解了由氨生成引起的尿路上皮侵蚀和炎症反应。免疫组化分析表明，uDHC+L组的细胞凋亡指数（TUNEL）高达约80%，而增殖指数（Ki-67）被显著抑制。同时，对重要器官的组织学评估未发现明显的系统毒性或病理性损害，进一步确认了其生物安全性。
总结与讨论部分翻译
本研究提出了一种基于尿酶驱动的Cu@PDA（uDHC）纳米药物的多功能膀胱内治疗策略。该单一治疗平台整合了原位铜催化聚多巴胺聚合、铜死亡和NIR-II光热治疗。通过利用尿酶赋予的运动能力和原位聚合，uDHC实现了增强的黏液渗透、延长的膀胱内滞留以及持续的治疗活性，且未引发可测量的不良生物学效应。持续释放的铜离子破坏了细胞内的铜稳态并促进了依赖铜离子的程序性细胞死亡，同时uDHC固有的光热特性协同放大了凋亡和免疫反应，产生了确切的抗肿瘤疗效。令人瞩目的是，铜死亡诱导与NIR-II光热治疗的结合实现了有效的肿瘤抑制，同时保留了正常的膀胱结构并最大程度减少了正常组织损伤。这种良好的安全性表现以及对主要器官组织学的保留，支持了该纳米药物平台用于局部膀胱癌治疗的转化可行性。
