葡萄糖-菊粉复合碳源能够提高ProSci-92型副干酪乳杆菌的最终存活细胞数，并与不同生长阶段的转录组及代谢组变化相关

《Food Bioscience》：A glucose–inulin composite carbon source increases the final viable cell count of Lacticaseibacillus paracasei ProSci-92 and is associated with stage-dependent transcriptomic and metabolomic responses

　　摘要：在高细胞密度条件下发酵副干酪乳杆菌时，保持较高的最终存活细胞数仍是一个重大挑战。本研究以ProSci-92株副干酪乳杆菌为研究对象，分别在其培养基中仅添加葡萄糖或葡萄糖与菊粉的复合碳源，于2小时、6小时和12小时时进行转录组学及非靶向细胞内代谢组学分析。12小时时，复合碳源组的最终存活细胞数约为单独葡萄糖组的5.9倍。6小时时，跨组学分析显示，主要的通路关联涉及淀粉和蔗糖代谢、赖氨酸降解、双组分系统以及ATP结合盒转运蛋白，表明在发酵中期转录组学和细胞内代谢组学差异最为显著。到12小时时，共同的通路信号主要与磷酸转移酶系统、半乳糖代谢及柠檬酸循环有关，同时伴有与应激反应或蛋白质质量控制相关的基因变化以及某些细胞内代谢物的变化，显示出在复合碳源培养条件下发酵后期的独特分子特征。总体而言，复合碳源培养有助于提高最终存活细胞数，并在发酵过程中引发阶段性的转录组学和细胞内代谢组学变化。这些发现为理解与ProSci-92株副干酪乳杆菌最终存活细胞数相关的碳源诱导的分子反应提供了基于组学的分析框架。

引言：近年来，益生菌因其潜在的健康益处而受到越来越多的关注。益生菌被定义为“当以适当剂量摄入时，能为宿主带来健康益处的活微生物”（Hill等人，2014）。副干酪乳杆菌是一种常用的乳酸菌，广泛用于乳制品的发酵过程；人们对其作为益生菌或作为混合发酵剂成分的保健功效进行了大量研究（Shah等人，2024）。例如，将副干酪乳杆菌YT805与菊粉一起用于牦牛奶的协同发酵，可生产出一种具有良好功能特性的食品，这类食品能够在维持理想的感官及理化特性的同时调节肠道微生物群（Yang等人，2025）。副干酪乳杆菌的工业应用效果在很大程度上取决于最终存活细胞产量以及下游加工过程中细胞的生理状态。要获得高存活细胞产量颇具挑战性，因为益生菌必须在工业发酵过程中恶劣的环境中生存，面临长期营养供应不足的情况，同时还需持续为食品的风味形成发挥作用。然而，它们本身对环境及生理应激的敏感性会导致其存活率大幅下降（Papadimitriou等人，2016）。

高细胞密度发酵是一种提高乳酸菌生物量产量及生产效率的有效方法（Lu等人，2022）。例如，在高密度发酵条件下，通过向培养基中添加海藻酸钠可显著提高植物乳杆菌P6的丰度并提升其存活率（Sun等人，2024）。不过，高密度发酵也面临着生长速率下降、抑制性代谢物积累以及菌株稳定性降低等问题。这些现象本质上与细胞密度增加后细胞对碳源、能量及生物合成前体的需求大幅上升有关。因此，碳利用效率及核心碳代谢成为影响存活细胞产量的关键因素（Lu等人，2018；Su等人，2023；Zhang等人，2024）。与单一快速代谢的碳源相比，复合碳源可在发酵过程中提供更为平稳的底物供应。然而，这类碳源组合所引发的阶段性分子反应目前尚未得到充分研究（Cui等人，2021）。

菊粉是一种源自植物的果聚糖，已被研究作为微生物发酵系统中的可发酵碳水化合物（Ahmed & Rashid，2019）。菊粉由β-(2,1)-连接的D-呋喃果糖残基构成的线性链组成，其还原端通过类似蔗糖的键合方式连接一个葡萄糖残基，可被微生物产生的菊粉酶水解为果糖、葡萄糖及菊粉低聚糖（Chi等人，2011）。副干酪乳杆菌含有一个菊粉基因簇，该基因簇编码果糖磷酸转移酶系统（PTS）蛋白（fosA、fosB、fosC和fosD）以及一种胞外β-果糖苷酶（fosE）。此外，在酸性条件下，果糖单元之间的β-(2,1)键容易发生部分水解（Shoaib等人，2016）。先前的研究表明，在特定条件下，菊粉可能会影响生物量形成及发酵进程。不过，含菊粉的复合碳源的具体作用可能因菌株特性及发酵条件而异（De Souza Oliveira等人，2012）。

近期研究主要聚焦于菊粉对细菌生长与代谢的促进作用以及发酵终点的变化，而与复合碳源培养相关的阶段性转录组学及细胞内代谢组学反应则了解不多（Cardarelli等人，2008；De Souza Oliveira等人，2012；Zhou等人，2025）。因此，目前尚不清楚在高细胞密度发酵的不同阶段，复合碳源培养如何影响与碳水化合物运输、核心代谢及应激相关分子反应的变化。整合转录组学与细胞内代谢组学分析能够从调控机制及代谢物特征层面提供关于碳源诱导的分子反应的互补信息，有助于识别高细胞密度发酵过程中的阶段性响应模式（L.Li等人，2023；M. Li等人，2025；Zhou等人，2025）。

本研究使用的ProSci-92株副干酪乳杆菌是从中国云南省香格里拉地区的传统发酵牦牛奶中分离得到的。先前的研究已表明，该菌株在长时间发酵过程中，尤其是在发酵初期，具有较强的生长能力与代谢活性（Wu等人，2025）。通过对ProSci-92株与P-8株的不同比例混合培养进行筛选，确定了1,000:1的最佳混合比例；采用该比例混合培养得到的发酵乳，其存活细胞数更高，持水能力更好，质地更优，感官评分也高于单菌株培养产品或市售的起始菌株产品L. paracasei PYS-010，显示出作为益生菌起始菌株的巨大潜力（Liu等人，2026）。另一项研究则表明，某种预生物素组合（1.959%的海藻糖、1.029%的菊粉以及1.582%的果寡糖）的最优比例可有效促进ProSci-92株副干酪乳杆菌的生长与代谢（Gao等人，2026）。此外，通过挤出法及内源乳化技术，利用海藻酸钠和大豆分离蛋白作为壁材料，还可进一步提高该菌株的存活率（Peng等人，2025）。

整合组学分析方法能为研究乳酸菌的发酵相关分子反应提供互补信息（Kwoji等人，2023）。本研究旨在探讨ProSci-92株副干酪乳杆菌在高细胞密度发酵过程中的生长表现及与碳源相关的分子反应。研究中比较了仅添加葡萄糖的对照组与添加葡萄糖-菊粉复合碳源组的细胞密度情况。为分析阶段性反应，分别在2小时、6小时和12小时时进行转录组学及非靶向细胞内代谢组学分析。与以往主要研究发酵终点生长表现或部分发酵相关指标的研究不同，本研究对ProSci-92株副干酪乳杆菌进行了分时间点的、针对特定菌株的多组学分析，明确了在复合碳源培养条件下最终存活细胞数较高的阶段性分子关联机制。

菌株来源：ProSci-92株副干酪乳杆菌是从中国云南省香格里拉地区天然发酵的牦牛奶中分离得到的，该菌株保存于内蒙古农业大学乳品生物技术工程重点实验室的乳酸菌菌种库中。储存在-80℃下的该菌株冷冻株在实验室常温（约20–25℃）下解冻后，以2%（体积比）的比例接入MRS培养基中。

高细胞密度发酵过程中的生长曲线及12小时的最终存活细胞数：在G组和复合碳源组中，ProSci-92株副干酪乳杆菌均表现出不同的生长规律（见图1A）。在发酵初期（0–4小时），两组的OD600值均逐渐上升，0小时、2小时及4小时时两组之间均无统计学上的显著差异。0小时时两组的OD600值分别为0.255 ± 0.002和0.266 ± 0.001，2小时时上升至0.911 ± 0.028和0.963 ± 0.026，随后继续上升……

讨论：乳酸菌的高密度细胞培养是生产直接发酵型起始菌株的关键环节，也是工业化生产过程中面临的重大挑战（Lu等人，2022）。本研究重点分析了ProSci-92株副干酪乳杆菌在高细胞密度发酵12小时时的最终存活细胞数。通过比较转录组学及非靶向代谢组学分析结果发现，葡萄糖-菊粉复合碳源会引发具有阶段性特征的响应模式……

结论：本研究表明，葡萄糖-菊粉复合碳源能够提高ProSci-92株副干酪乳杆菌在高细胞密度发酵过程中的最终存活细胞数。整合RNA测序数据与非靶向细胞内代谢组学分析结果显示，该菌株存在阶段性分子响应特征：2小时时差异较小，6小时时基于RNA测序的转录组学及细胞内代谢组学差异最为明显，12小时时则出现独特的后期分子特征。6小时时，跨组学分析显示……

局限性：本研究的局限性在于，所进行的整合转录组学及细胞内代谢组学分析属于相关性分析。尽管综合组学分析结果揭示了不同通路、基因及细胞内代谢物特征之间的阶段性关联，但并未能确立特定的分子变化与复合碳源培养条件下观察到的较高最终存活细胞数之间的因果关系。此外，代谢组学分析仅限于细胞内代谢物层面……

伦理声明：本文未涉及任何由作者实施的人体或动物实验研究。

作者贡献说明：Shijia Shen：撰写——审阅与编辑、方法学、研究实施、正式分析；Xuan Li：撰写——审阅与编辑、正式分析；Shuaisen Gao：撰写——审阅与编辑、方法学；Jie Yu：撰写——审阅与编辑、方法学、资金获取、数据整理、概念构建；Hua Wang：撰写——初稿撰写、可视化处理、资源准备、方法学、研究实施、正式分析；Peng Liu：撰写——初稿撰写、监督工作、资源准备、方法学、研究实施。

未引用参考文献：Champagne等人，2011；Cui，2021；Hill，2014；Konstantinos等人，2016；Li等人，2025；Torres-Miranda，2022；Yang，2025。

数据可用性：数据将应请求提供。

资金支持：本研究得到了内蒙古自治区高校青年科技人才计划（NJYT22036）、内蒙古农业大学食品科学与工程学院科技项目（SPKJ202001）、内蒙古自治区科技项目（2025KYPT0114）以及内蒙古自治区直属高校基础研究业务费项目的资助。

利益冲突声明：作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

Hua Wang | Peng Liu | Shijia Shen | Xuan Li | Shuaisen Gao | Jie Yu
内蒙古农业大学乳品生物技术工程重点实验室，中国呼和浩特市