利用填充有蛋白质的色谱柱通过反相液相色谱研究大豆蛋白与醛的结合情况

《Food Chemistry》：Probing soy protein-aldehyde binding by inverse liquid chromatography on protein-packed columns

　　

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  疏水效应在长链醛与植物蛋白的结合中起着关键作用。
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  ILC技术可用于研究植物蛋白与风味物质之间的动态结合行为。
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  可估算因强烈的或不可逆的蛋白质相互作用而导致的风味损失。
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  在含有癸醛的双重风味体系中观察到了协同结合效应。
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  ILC与HS-GC–MS相结合，为研究SPI与醛的结合提供了互补的见解。

引言

将饮食结构从以肉类蛋白为主转变为以植物性食物为主，是当前全球范围内的重要食品趋势，其背后的动力是为不断增长的世界人口提供营养丰富且可持续的蛋白质来源（Wang et al., 2023; Xavier et al., 2025）。大豆分离蛋白因其较高的营养价值以及良好的功能特性，已成为最具前景的植物蛋白之一。然而，阻碍其广泛应用的一个长期存在的问题，便是其中存在的各种易挥发的不良风味化合物，包括醛类、酮类、酯类以及含硫分子。这些化合物很难从蛋白质基质中去除，会带来诸如“草味”、“豆味”或“土味”等不良感官体验，从而显著降低人们对植物性食品的接受度（Wang et al., 2022）。

在真实的食品基质中，蛋白质、游离氨基酸、多肽以及其他小分子，如胺类和硫醇类，都可能参与与风味的分配平衡过程（Zhou & Decker, 1999）。不过在富含蛋白质的体系中，由于蛋白质的数量更多且结构更为多样，因而通常具有更强的结合能力，能够提供多种结合位点及微环境，从而在整体结合过程中起主导作用（Mittermeier-Kle?inger et al., 2021）。相比之下，小分子则主要起到辅助或竞争性结合伙伴的作用，影响平衡分布状态。由于蛋白质与不良风味化合物之间持续存在的相互作用，往往需要在植物性食品配方中添加更高剂量的风味物质，比如添加吡嗪类和呋喃类物质来营造烤制风味，添加醛类物质来产生油脂香气，再添加酯类或萜烯类物质来掩盖不良风味（Cascos et al., 2024; Niu et al., 2025; Tsuzuki, 2019）。蛋白质可以通过非共价相互作用（如氢键或疏水作用），或是形成共价键——例如风味物质中的醛基与蛋白质中的游离氨基形成席夫碱——来吸附这些不良风味化合物以及所添加的掩味剂（Zhang et al., 2021）。与蛋白质相关的挥发性分子在储存或加工过程中可能会逐渐释放，其释放程度决定了植物性产品的最终感官品质（Ammari & Schroen, 2018）。因此，那些能够在分子层面探究这些相互作用的分析方法，对于理解不良风味的结合机制，以及控制植物性食品中不良风味化合物的保留与释放，具有至关重要的意义。

目前已有多种分析方法被用于研究蛋白质与风味之间的相互作用。顶空气相色谱-质谱法（HS-GC–MS）是最常用的量化风味结合比例的方法（Wang & Arntfield, 2015）。结合克洛茨模型（Scatchard, 1949）或希尔模型（Harrison & Hills, 1997）这类经典结合模型，HS-GC–MS能够提供有关平衡特性的信息，包括结合常数以及结合位点的数量。在热力学研究中，差示扫描量热法常被用来分析存在风味分子时蛋白质的热稳定性（Xu et al., 2024）。等温滴定量热法则通过测定风味物质滴加到蛋白质溶液过程中的热量变化，进而通过数据拟合来估算焓变（ΔH）、熵变（ΔS）以及结合常数等热力学参数（Li et al., 2025）。荧光、紫外-可见光谱以及圆二色光谱等光谱学方法，则可用于追踪风味物质与蛋白质结合后蛋白质构象的变化情况（Guo et al., 2024），而核磁共振光谱则能够提供关于这些分子过程背后原子级结构信息的分析手段（Lübke et al., 2002）。与HS-GC–MS类似，这些热力学和光谱学方法主要描述的是平衡状态下的最终结果，无法实时展现吸附-解吸过程的变化情况。然而蛋白质体系中的风味结合与释放过程具有很强的动态性，仅依靠平衡状态下的测量结果，很可能会忽略那些短暂的结合行为以及不同的作用机制。为了解决这些局限性，有必要开发出一种能够在高蛋白质含量体系相关的动态条件下模拟相互作用特性的方法。

逆相液相色谱法（ILC）正是为此提供了一种可能性，因为它可以利用经过精心设计的探针分子来表征未知的固定相性质（Bednar et al., 2012）。ILC已被广泛用于研究固体材料的吸附行为、表面能量以及亲和力特性（Adamska et al., 2016）。不过，它在风味科学领域的应用仍然较为有限。在用于研究蛋白质与风味的相互作用时，目标蛋白质会被固定在某种支撑材料上，或者与支撑材料混合在一起形成固定相，各类化合物的保留行为则反映了它们与蛋白质的亲和力大小（Sostmann & Guichard, 1998）。这样一来，就可以在持续的吸附-解吸条件下研究蛋白质与风味之间的相互作用，并且能够估算出与结合相关的各种参数（Slomkiewicz et al., 2015）。不过，在将ILC应用于蛋白质与风味的体系时，需要考虑若干固有的局限性。蛋白质被固定在固体支撑材料上后，其构象以及结合位点的可及性可能会与它们在水环境中的天然状态有所不同。此外，色谱分析所涉及的流动动力学以及系统压力等条件，也与真实食品基质中的条件存在差异，这些都可能影响所观察到的相互作用表现。因此，这种方法更应被视为一种能够为吸附-解吸行为提供动态视角的分析手段，而非能够直接反映复杂食品体系中平衡状态的方法。

要开展可靠的ILC实验，首先需要使用填充均匀且固定相为蛋白质的色谱柱。Sostmann等人通过将β-乳球蛋白共价连接到硅胶颗粒表面的氨基上，实现了对该蛋白的化学固定，随后研究了在不同pH值和蛋白质浓度条件下24种风味化合物的保留情况（Sostmann & Guichard, 1998）。该实验装置设计简单，能够在受控条件下快速、高效地评估蛋白质与风味之间的相互作用。不过，与β-乳球蛋白这类动物蛋白不同，植物蛋白通常由多个亚基组成，且在水和有机溶剂中的溶解度都很低。这些特性使得通过共价方式固定植物蛋白变得十分困难，因此需要开发其他方法来制备填充了植物蛋白的ILC色谱柱。

在本研究中，为了让ILC方法能够用于分析植物蛋白，我们简化了色谱柱的制备流程，直接将SPI与某种固体支撑材料混合后进行填充。利用这种经过蛋白质修饰的色谱柱，我们分析了六种不同链长的线性醛类不良风味物质的保留行为，以此评估它们与SPI之间的相互作用。同时，我们也研究了温度和风味浓度等外部因素对吸附过程的影响。此外，我们还研究了双重风味体系，旨在判断是否存在风味物质的置换效应或协同结合效应。与此同时，我们还采用了HS-GC–MS方法来量化水体系中的风味物质保留与释放情况。需要指出的是，这两种分析方法所模拟的环境存在明显差异。所观察到的差异，既可能反映出在不同平衡条件下蛋白质与风味结合机制的互补性，也可能源于ILC中的填充色谱环境与HS-GC–MS中的水环境之间的本质差别。

章节要点

试剂与材料

超纯水是从Millipore ZMQSP0D01 Q-POD水净化系统（德国达姆施塔特的Merck KGaA公司生产）中获取的。作为代表性商业产品，大豆分离蛋白（Supro EX 37 HG IP，蛋白质含量超过80%，脂肪含量低于1%）是从美国密苏里州圣路易斯的Solae公司购买的。为了更真实地模拟实际食品体系，我们选择了市售的大豆分离蛋白而非经过高度纯化的大豆蛋白。文中出现的线性醛类不良风味物质及其缩写如下：戊醛

选择与蛋白质混合的支撑材料

醛类风味物质是SPI中常见的不良风味成分，通常是由脂质氧化产生的，且它们的紫外吸收强度较弱。为确保ILC系统适用于检测醛类物质，我们首先对检测装置进行了测试。我们使用了DAD检测器来确定最大吸收波长，同时还使用了RID检测器来确认信号（见图S1）。在自装填的硅胶色谱柱上分析300毫克/升浓度的己醛时，会在280纳米处出现一个尖锐且对称的DAD峰，这一结果与预期相符

结论

在本研究中，我们开发了一种用于研究蛋白质与风味相互作用的ILC分析系统。实验结果表明，可逆的醛类与蛋白质之间的相互作用主要受疏水效应调控，可以用线性的亨利型吸附模型来描述。双重风味实验进一步表明，在存在癸醛这类具有强相互作用能力的化合物时，会出现协同结合效应。各项吉布斯自由能数值显示，所有被检测的醛类物质之间的相互作用都是自发发生的，但强度较为适中

CRediT作者贡献说明

刘民聪：论文撰写——初稿撰写、验证、方法设计、实验开展、正式分析、概念构思。 Neil C. Da Costa：论文撰写——审阅与编辑、项目管理。 陈波：论文撰写——审阅与编辑。 Bauke Albada：论文撰写——审阅与编辑、指导监督、项目管理、方法设计。 Hans-Gerd Janssen：论文撰写——审阅与编辑、指导监督、资源协调、项目管理、方法设计、概念构思。

利益冲突声明

作者们声明存在以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益或个人关系：Hans-Gerd Janssen在联合利华公司工作，这是一家致力于生产食品以及家居和个人护理产品等消费品的跨国企业；Neil C. Da Costa则是国际香精香料公司的员工，该公司也从事口味和香气相关产品的研发工作。作者们表示自己不存在其他需要声明的利益冲突。

致谢

作者们感谢联合利华食品创新中心——Hive，国际香精香料公司，以及中国国家留学基金委员会所提供的资金支持。同时，我们也衷心感谢Herrald Steenbergen、Oscar Dofferhoff以及Cristina Barallat-Pérez在GC–MS实验方面给予的指导帮助。此外，作者们还要感谢Krishna Mahabir在ILC系统搭建方面提供的协助，以及Julien Boelhouwer在蛋白质含量检测工作中所做出的贡献。

刘民聪|Neil C. Da Costa|陈波|Bauke Albada|Hans-Gerd Janssen