γ-和α-萜品烯在散装与结构化脂质体系中抗氧化行为的pH依赖性与相依赖性

《Food Chemistry》：pH- and phase-dependent antioxidant behavior of γ- and α-terpinene in bulk and structured lipid systems

　　

脂质过氧化（Lipid peroxidation, LP）是含脂食品质量劣变的主要原因，会导致营养损失、潜在有毒次级氧化产物形成以及不良风味和气味产生。多不饱和脂肪酸在散装油、水包油乳液及食品基质中常见的其他结构化脂质体系中尤其易发生自由基自氧化。控制LP对于提高氧化稳定性、延长货架期及维持感官品质至关重要。抗氧化剂通过预防自由基形成和中断自由基链传播两种主要机制减轻LP。预防性抗氧化剂降低引发速率，例如螯合过渡金属或分解脂质氢过氧化物；链断裂抗氧化剂（亦称自由基捕获抗氧化剂）直接与脂质过氧自由基反应以抑制传播。然而，真实食品体系中的抗氧化效率不能仅从键解离能或自由基稳定化等分子固有性质预测。在乳液和胶束等非均相环境中，抗氧化性能受界面定位和质子化平衡强烈影响，这些物理化学因素决定了自由基物种的局部浓度和反应性，可能导致与均相有机溶剂中截然不同的行为。精油作为食品天然抗氧化来源日益受到关注，其主要成分单萜和倍半萜及相关化合物可干扰脂质自氧化。其中γ-萜品烯（γ?Terpinene, γ?T）和α?萜品烯（α?Terpinene, α?T）等萜烯烃表现出不符合经典酚类链断裂范式的异常抗氧化行为。研究人员此前证明γ?T可通过非经典机制抑制胶束和磷脂膜模型中的LP：与脂质过氧自由基反应后，相应过氧中间体断裂生成对异丙基甲苯（p?cymene）和氢过氧自由基（HOO•），HOO•较小且极性更强，可迁移至界面或水相域，有效降低脂相内链传递自由基浓度，这种“自由基导出（radical export）”机制提供了经典酚类链断裂抗氧化活性之外的替代途径。然而HOO•与超氧阴离子（O2•?）之间的酸碱平衡如何影响食品相关条件下的抗氧化性能仍待解决，两者氢抽象反应性差异显著，相对丰度强烈依赖于pH（HOO•的pKa≈4.8）。食品体系pH范围广泛，HOO•/O2•?平衡可能决定促芳香族萜烯表现为净抗氧化还是促氧化行为，且相组织（散装油 vs 胶束和脂质体样组装等区室化系统）如何调节导出自由基等价物的命运尚未系统研究。本研究通过比较分析γ?T及其结构异构体α?T在不同pH值的均相散装脂质体系和结构化脂质环境中的抗氧化行为来解决上述空白，结合动力学测量、产物分析和建模评估自由基形态和相分配如何控制抑制–促进行为，并在HepG2细胞LP诱导模型中评估这些效应的功能相关性，以将机理见解与食品体系相关的生物氧化过程联系起来，旨在阐明环境因素如何决定促芳香族萜烯的抗氧化效率，为其结构化脂质基质中的合理应用提供指导。

研究背景方面，脂质过氧化是导致含脂食品质量下降的核心问题，会引发营养流失、毒性次级产物积累及风味劣变。传统认为抗氧化效率取决于分子固有性质如键解离能，但在食品常见的非均相结构化体系中，界面定位、质子化平衡及相分布会显著改变自由基行为与抗氧化表现。经典酚类抗氧化剂如α?生育酚通过链断裂机制发挥作用，而精油中的萜烯烃如γ?萜品烯和α?萜品烯可通过非经典的自由基导出机制参与抗氧化，即其与脂质过氧自由基反应后断裂生成对异丙基甲苯和HOO^•，将自由基等价物导出脂相。但目前HOO^•/O₂^•?的pH依赖平衡及相组织对萜品烯抗氧化或促氧化转变的调控尚不明确，食品基质跨度从酸性调味品到近中性乳肉制品，系统解析环境因子对该类萜烯行为的影响具有重要理论与应用价值。因此研究人员开展本研究，比较γ?T和α?T在均相散装脂质、水相分散体系、胶束及脂质体等不同模型中、不同pH下的抗氧化表现，结合动力学与产物分析阐明机理，并在HepG2细胞中验证生物学相关性，最终为其在结构化脂质食品体系中的合理使用提供依据。该研究发表于《Food Chemistry》。

主要关键技术方法包括：在散装脂质体系中采用气相摄取装置监测氯苯中甲基亚油酸酯（MeLH）的自氧化耗氧动力学；在水/THF体系中利用STY?BODIPY探针分光光度法检测缓冲水相中氧化速率；在Triton X?100胶束体系中通过紫外可见光谱监测界面脂质氧化；在蛋黄磷脂酰胆碱（PC）脂质体中用光学氧仪测定O₂消耗以评估膜氧化；采用碘硝基四唑氯化物（INT）还原法检测超氧阴离子（O₂^•?）生成；通过高效液相色谱（HPLC）定量对异丙基甲苯（Cym）以追踪萜品烯芳构化；细胞实验采用结晶紫增殖实验、IncuCyte实时活细胞增殖分析及STY?BODIPY膜过氧化荧光成像评估HepG2细胞经RSL3诱导的铁死亡样脂质过氧化及保护作用；所有数据通过共氧化方程进行非线性数值拟合及统计学分析。

研究结果部分保留原文小标题并依内容总结如下。

3.1. Autoxidation studies

研究人员在四种模拟食品相关环境中评价γ?T和α?T的抗氧化活性，对照包括非促芳香烃p?cymene（Cym）和β?myrcene（Myr）及经典抗氧化剂α?tocopherol、Trolox、PMC。体系包括散装有机相MeLH/氯苯、水相THF/缓冲水、Triton X?100胶束中MeLH及PC脂质体。结果表明在均相MeLH自氧化中，γ?T和α?T降低摄氧率但无明确诱导期，呈浓度依赖的抑制或促进双向行为，Cym和Myr无活性，说明其非经典链断裂而是竞争自由基过程，且需1,4?环己二烯骨架；α?T促氧化效应强于γ?T。在pH 7.4的水/THF体系中，两萜品烯在亚毫摩尔浓度下有效抑制探针氧化，高浓度也无促氧化；pH 4.5时则出现低浓度抑制、高浓度促进的双相行为，证实HOO^•质子化状态影响反应性。在胶束体系中，pH 4.5与7.4下均全浓度范围显示抗氧化，说明区室化限制HOO^•重回脂相。在PC脂质体中，两萜品烯浓度依赖抑制耗氧，活性接近α?tocopherol但需更高浓度，Cym和Myr无活性。整体表明其行为由自由基捕获与共氧化/传播路径的微妙平衡决定，符合自由基导出而非经典链断裂。

3.2. Cellular model of lipid peroxidation

为评估模型脂质体系结果是否适用于生物膜，研究人员用HepG2细胞经RSL3（谷胱甘肽过氧化物酶4抑制剂）诱导脂质过氧化。350 nM RSL3处理4小时使细胞活力降逾50%，共处理γ?T或α?T剂量依赖维持活力，Cym和Myr几乎无保护，Ferrostatin?1为阳性对照完全防护。实时增殖分析证实γ?T和α?T在氧化挑战中维持细胞生长；共聚焦显微镜STY?BODIPY显示两萜品烯提高还原/氧化荧光比，减少膜脂质氧化，且所用浓度无内在细胞毒性。结果与模型体系自由基导出机制一致，表明促芳香萜烯可在细胞语境减弱膜脂质过氧化，支持其作为膜活性抗氧化剂在富脂食品基质中的潜在适用性。

3.3. Mechanistic interpretation: Radical export and pH dependence

研究人员在共氧化框架中解释结果：引发剂恒定速率R_i产生活性自由基并快速生成ROO^•，ROO^•可从底物RH或萜品烯TH夺氢传播链；关键步骤是萜源过氧自由基TOO^•快速断裂生成HOO^•与Cym。INT还原证实脂质体中O₂^•?生成，HPLC证实中性水条件下γ?T定量转为Cym，α?T产Cym较少。提出三环境区：散装有机体系中HOO^•留于有机相，低浓度时终止占优呈抑制，高浓度时HOO^•通过夺氢参与传播致促进；水/THF混合物pH 7.4时HOO^•转O₂^•?削弱传播，全浓度抑制，pH 4.5偏向HOO^•表现似有机相；结构化脂质体系（胶束、脂质体）中相组织限制HOO^•重回脂域，即使质子化也优先分配入水区，从而持续抑制。抗氧化效率受质子化平衡与相分布环境门控，决定导出自由基等价物是否重入脂相传播。

3.4. Comparison between γ?terpinene and α?terpinene

尽管共享促芳香环己二烯骨架，γ?T与α?T表现不同：α?T在均相有机相和pH 4.5水相中抑制更弱、促氧化更强，且Cym产率远低于γ?T。原因在于α?T的1,3?二烯共轭体系利于过氧自由基加成（PRA）路径，形成可持续传播的自由基并产复杂含氧产物；γ?T优先氢原子转移（HAT）后TOO^•快速裂解为Cym，高效导出HOO^•。故γ?T是更“干净”的自由基导出者，α?T部分分流至传播性含氧产物，解释二者在不同环境中抗氧化/促氧化平衡差异。

3.5. Quantitative effectiveness and formulation considerations

研究人员将LP速率降低对归一化至双烯丙基位的萜品烯浓度作图，异质体系（胶束、脂质体）需约0.5–2 mol%萜品烯相对于双烯丙基基团以实现60–70%速率降低，折合约0.2–1 wt%相对于可氧化脂质；散装MeLH中γ?T仅有限抑制，α?T主要呈促氧化。虽此用量高于高效酚类抗氧化剂，但γ?T和α?T是烹饪精油天然组分，在香辛料油、腌料、加工肉等风味较强体系中感官兼容，中性精炼油中需谨慎评估。前人报道γ?T与酚类抗氧化剂协同可降用量，萜烯烃挥发性可通过乳化界面定位或包封缓解，配方设计、基质组成与协同作用决定实际应用。

总结讨论部分，研究人员指出促芳香萜烯γ?T和α?T的抗氧化行为非分子固有属性，而受自由基形态与区室化的环境控制门控。γ?T向脂质过氧自由基氢转移后快速芳构化为Cym并生成HOO^•，导出自由基后续命运（终止、重引发传播或转为O₂^•?）由介质极性、相组织及pH依赖的HOO^•/O₂^•?平衡决定，故同一分子可依物理化学环境表现为抗氧化或促氧化。均相散装脂体系中HOO^•留有机相呈浓度依赖抑制–促进；区室化如胶束和PC脂质体中界面约束及HOO^•优先分配入水抑制其重回脂相，全浓度持续抑制；γ?T的1,4?环己二烯框架利高效自由基导出，α?T竞争过氧加成削弱净抗氧化。异质体系需约0.5–2 mol%萜品烯相对双烯丙基脂位点（约0.可氧化脂0.2–1 wt%）获显著抑制，此类水平在天然含萜食品基质中可能感官兼容，且与酚类协同可降量，挥发性与界面定位影响实际保留。两萜品烯在HepG2细胞中防护RSL3诱导LP且无毒性，支持自由基导出机制的生物学相关性及其在富脂生物与食品体系中应用潜力。该研究确立自由基导出为环境门控抗氧化策略，效能依赖物理化学语境，为促芳香萜烯在结构化脂质体系合理使用提供机理指导，强调调控pH、相组织与协抗氧组成以最大化防护并最小化促氧化风险。

翻译研究结论部分如下：

本研究证明促芳香萜烯特别是γ?萜品烯和α?萜品烯的抗氧化行为并非分子固有性质，而是强烈受自由基形态与区室化的环境控制所支配。向脂质过氧自由基氢转移后，γ?萜品烯快速芳构化为对异丙基甲苯并伴随生成氢过氧自由基（HOO^•）。此导出自由基的后续命运——终止、传播的重引发或转化为超氧阴离子（O₂^•?）——由介质极性、相组织及pH依赖的HOO^•/O₂^•?平衡决定。因此同一分子可依据物理化学环境表现为抗氧化或促氧化行为。在HOO^•留存于有机相的均相散装脂质体系中，观察到浓度依赖的抑制–促进机制；相反在胶束和磷脂酰胆碱脂质体等区室化系统中，界面约束与HOO^•优先分配入水域抑制其重回脂相，导致在所研究浓度范围内持续抑制。γ?萜品烯与α?萜品烯的比较进一步凸显分子结构重要性：γ?萜品烯的1,4?环己二烯骨架利于高效自由基导出，而α?萜品烯经历竞争性过氧加成路径削弱其净抗氧化表现。定量上异质体系约需0.5–2 mol%萜品烯相对于双烯丙基脂位点（约可氧化脂重的0.2–1 wt%）以实现显著抑制；此类水平在天然含萜烯烃的风味较强食品体系中可能感官兼容，且既往报道γ?萜品烯与酚类抗氧化剂协同暗示优化配方中更低萜用量或已足够，挥发性、基质分配与界面定位对实际应用至关重要。重要的是两萜品烯在无检出毒性的情况下保护HepG2细胞免受RSL3诱导的脂质过氧化，支持自由基导出机制的生物学相关性并强化其在氧化降解损害质量与稳定性的富脂生物及食品体系中潜在适用性。总体而言，本工作确认自由基导出为一种环境门控抗氧化策略，其有效性取决于物理化学语境；这些发现为促芳香萜烯在结构化脂质系统中的合理使用提供机理指导，并强调调节pH、相组织与协抗氧组成以在真实食品基质中最大化防护同时最小化促氧化风险的重要性。