通过共固定化β-葡萄糖苷酶-腈水解酶策略提升发酵食品中的氰化物还原效率

《Food Bioscience》：Enhanced cyanide reduction in fermented foods via a co-immobilized β-glucosidase-nitrilase strategy

　　

摘要

植物来源的发酵底物中的氰苷在加工过程中可能会释放出氢氰酸，从而带来食品安全风险。在本研究中，我们提出了一种“通过转化降低氰化物”的策略，即将β-葡萄糖苷酶介导的氰苷水解与腈水解酶催化的释放出的氰化物中间体转化相结合。β-葡萄糖苷酶可将氰苷转化为对羟基扁桃腈，后者进一步分解为对羟基苯甲醛和氢氰酸。随后，氢氰酸会被腈水解酶分解为甲酸盐和氨，从而形成闭环转化。这种双酶系统在6小时内就能将99%以上的氰苷降解，有助于将氰化物中间体转化为下游产物。为增强其在酸性发酵条件下的稳定性，我们对腈水解酶进行了合理改造，得到了具有更强催化稳定性的耐酸双突变体（F232E-R270D），在pH 4.0时仍能保持80%以上的相对活性。我们将经过改造的腈水解酶和β-葡萄糖苷酶共固定在一个食品级的海藻酸-壳聚糖/明胶-TGase基质中，从而形成了可重复使用的双酶系统。该共固定系统有效降低了竹笋发酵过程中的氰化物含量，14天后其氰化物含量比对照组低约60%。这项研究为传统发酵食品中的氰化物控制提供了一种与食品相容且具有可持续性的酶法解决方案。

引言

用于食品发酵的植物源性材料中广泛存在氰化物及其前体，这些物质会带来严重的食品安全和毒理学风险（Nielsen等人，2002；Vetter，2000）。主要的氰苷类物质（如杜林、亚麻苦苷、澳大利亚苦苷、李子苷、维西苷、杏仁苷以及紫叶苷）源自酪氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸等氨基酸（Azi等人，2025；Franks等人，2005；Shlichta等人，2014）。其中，来自高粱的杜林和来自竹笋的紫叶苷是谷物和蔬菜发酵过程中常见的芳香族氰苷。尽管它们的糖核结构有所不同，但这两种化合物都能被β-葡萄糖苷酶水解，生成α-羟基腈中间体，而这些中间体又会自发分解为氢氰酸（Singhal等人，2013）。因此，发酵食品中的氰化物控制需要同时解决游离氰化物的去除和前体转化问题，同时还要尽量降低乙基氨基甲酸酯的风险（Zhao等人，2013）。

发酵竹笋是一种传统的酸性发酵蔬菜，在中国和东南亚地区广泛食用。在制作酸竹笋的过程中，去皮、切片、浸泡以及自然发酵都会破坏植物组织，增加紫叶苷与内源或微生物产生的β-葡萄糖苷酶的接触机会，从而促进氰化物的释放（Singhal等人，2013）。由于乳酸菌逐渐主导发酵过程并使环境变酸，发酵过程中释放的氰化物可能以易挥发的氢氰酸形式存在，因此在这样的酸性食品体系中，氰化物控制尤为重要（Chen等人，2022；Li等人，2026；Zhang等人，2024）。不同种类的竹笋中氰化物含量差异很大。例如，常用于制作发酵竹笋的宽叶竹的氰化物含量据报道为790.2 ± 33.4毫克/千克（Niyogi等人，2025）。虽然传统的预处理方法可以降低氰苷类物质的含量，但其解毒效果会因竹子种类、组织成熟度、组织破坏程度以及加工条件的不同而有所差异（Yi等人，2020）。如此高的前体含量，再加上传统预处理方法的效果不确定性，表明在正常发酵过程中氰化物仍可能持续释放。此外，还有报道称发生过一起因吸入竹笋发酵过程中产生的氢氰酸而导致的群体急性氰化物中毒事件，不过这属于非正常的暴露情况，而非日常饮食摄入所致（Sang-A-Gad等人，2011）。因此，这里要解决的安全问题并非发酵竹笋本身是否不安全，而是如何在酸性发酵过程中更好地控制氰化物的释放与去除。

目前，发酵食品中的氰化物控制策略主要包括物理处理、微生物降解和酶法解毒。物理方法如浸泡、加热、干燥、挥发以及反复清洗，可以通过浸出、热分解和蒸发等方式降低氰化物含量（Bjarnholt等人，2018；Ikediobi & Olugboji，1988；Shen等人，2021）。然而，这些方法的效率会受到原料组成、加工强度以及发酵条件的显著影响，而且过度加工还可能损害食品的营养价值和感官品质。利用具有氰化物降解能力的酿酒酵母进行微生物发酵的方法已在复杂的发酵食品体系中得到验证（Sharma等人，2019；Shen等人，2021）。不过，这类微生物并不一定适用于以耐酸乳酸菌为主的竹笋发酵过程（Zhang等人，2024）。因此，需要一种更适合酸性发酵、能够更有效地降低发酵竹笋及其他酸性发酵食品中氰化物含量的控制策略。

酶法解毒是一种很有前景的替代方案，因为它能够在温和的食品加工条件下催化特定的反应。在发酵环境中，β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）能够催化β-D-糖苷键的断裂，加速氰苷的水解过程（Sun等人，2025）。然而，如果不对释放出的氰化物进行进一步处理，仅靠β-葡萄糖苷酶的活性反而可能导致游离氰化物积累增多（Han等人，2021；Tokpohozin等人，2018）。因此，有效的解毒需要一个能够同时促进前体水解和氰化物降解的耦合催化系统。腈水解酶能够催化腈类或氰化物分解为毒性较低的产物，如羧酸和氨（图1）（Rangel-González等人，2024；Xia等人，2024）。从原理上讲，将β-葡萄糖苷酶与腈水解酶结合使用，就可以通过将氰苷转化为后续的氰化物转化产物，从而形成完整的解毒循环。大多数β-葡萄糖苷酶的最适pH值在4-6之间，这一范围很适合酸性发酵体系（Yu等人，2025）。然而，大多数天然存在的腈水解酶在最适活性状态下处于中性或碱性环境，而在酸性环境中的稳定性较差，这就限制了它们在发酵竹笋这类酸性发酵食品中的应用（Arevalo等人，2022；Jiang等人，2026；Jones等人，2021；Zhang等人，2014）。

另一个实际问题在于，腈水解酶催化的氰化物水解会产生氨作为副产品。在酸性发酵条件下，游离氨大多会以铵离子的形式存在，这降低了氨的挥发性以及产生气味的概率（Emerson等人，1975；Hopton & Cockell，2026）。此外，在自然发酵过程中，本土微生物也可能对铵离子进行吸收或转化，不过其实际积累量取决于氰化物转化、微生物氮代谢以及氮化合物降解之间的平衡关系（Kosem等人，2026；Zhang等人，2024）。因此，一种耐酸且可分离的固定化酶系统可能更适合酸性食品发酵过程。

基于以上考虑，当前的关键研究缺口在于缺乏一种在酸性发酵条件下既能水解氰苷又能解毒的、与食品相容的强大生物催化系统。在我们之前的研究中，我们在一种酸性发酵系统中发现了一种具有耐酸特性的新型腈水解酶（Jiang等人，2026）。为弥补这一不足，本研究建立了一种双酶策略，即让β-葡萄糖苷酶负责催化氰苷的水解，而腈水解酶则负责将释放出的氰化物进一步降解为毒性较低的物质。在蛋白质结构建模和静电表面分析的指导下，我们构建了一种耐酸的腈水解酶突变体，然后将其与β-葡萄糖苷酶一起固定在一个食品级的海藻酸-壳聚糖/明胶TGase基质中（Jiang等人，2026；Schreiner等人，2010；Singh，2025；Zhang等人，2023）。本研究以杜林作为代表性的氰苷，以发酵竹笋作为实际的酸性发酵基质，评估了该共固定双酶系统的催化机制、耐酸性能、固定化效果以及实际的解毒潜力。

章节摘录

试剂与材料

乙腈、甲酸和甲醇（色谱级）购自中国上海的赛默飞世尔科技公司。氰化物标准溶液（浓度为100微克/毫升，CAS编号：CDZD-BW26709-2016）则从中国北京的北京谱瑞科技有限公司购买。其他所有试剂均由中国上海的当地化学试剂公司提供。用于实验的竹笋要求外观正常、大小均匀且新鲜，取自中国广东省揭阳市。

β-葡萄糖苷酶与腈水解酶的转化实验

商业化的β-葡萄糖苷酶（GH1

β-葡萄糖苷酶与腈水解酶在氰苷降解中的协同作用机制

为阐明该双酶系统的降解机制，我们选择了杜林作为模型底物。由于紫叶苷的标准品难以获得，因此选择了代谢途径与紫叶苷相同的杜林（Singhal等人，2013）。这种共同的中间体表明，杜林和紫叶苷的降解过程是相似的，首先生成对羟基扁桃腈，接着生成对羟基苯甲醛和氢氰酸，最后生成甲酸盐和氨。这代表了

结论

本研究通过将β-葡萄糖苷酶介导的氰苷水解与耐酸腈水解酶突变体F232E-R270C的氰化物转化相结合，为发酵食品开发出了一种双酶氰化物还原策略。该突变体具有更好的静电平衡性和耐酸性，它与β-葡萄糖苷酶一起被固定在一个食品级的钙盐-海藻酸/壳聚糖-明胶基质中，经过多次使用后仍能保持80%以上的活性。

在酸性竹笋发酵条件下，1小时后

CRediT作者贡献说明

吴群：撰写——审阅与编辑，正式分析。 聂瑶：撰写——审阅与编辑，指导监督。 蒋玉山：撰写——审阅与编辑，原始稿撰写，可视化分析，实验研究。 姚志豪：撰写——审阅与编辑

未引用参考文献

Sang-A-Gad等人，2011年。

利益冲突声明

作者们不存在与本文内容相关的任何利益冲突需要声明。

数据可用性

数据将在有需求时提供。

利益冲突声明

作者们不存在与本文内容相关的任何利益冲突需要声明。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（编号：32172175）、江苏省高等教育重点学科建设工程、111计划（编号：111-2-06）以及中央高校基本科研业务费（编号：JUSRP202404014）的支持。

蒋玉山|姚志豪|吴群|聂瑶

中国江苏省无锡市江南大学生物技术学院，食品科学与资源国家重点实验室，教育部工业生物技术重点实验室，邮编：214122