阿格瑞汀对AgrA裂解TR结构域-agr操纵子复合物形成的抑制机制及其在牛肉中的应用

《Food Research International》：Inhibitory mechanism of phloretin on the AgrA LytTR domain-agr operon complex formation and its application in beef

　　

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  阐明了黄酮素对AgrA LytTR-agr复合物的抑制机制。
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  成功纯化了AgrA LytTR结构域蛋白。
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  EMSA实验确认黄酮素可干扰AgrA LytTR结构域与P3启动子的结合。
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  分子动力学模拟表明黄酮素通过空间位阻阻碍AgrA与agr的结合，这一结论也得到了混合荧光淬灭实验的验证。
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  黄酮素可作为QSI，抑制牛肉中肠毒素和溶血素的分泌。

引言

金黄色葡萄球菌是一种重要的食源性病原体，它具有极强的环境适应能力以及多种抗菌耐药机制（Willyard, 2017）。该细菌能产生葡萄球菌肠毒素，这类毒素热稳定性极高，即便经过常规食品加工处理也能存活很长时间，从而引发严重的食品安全问题（Lv et al., 2021）。流行病学研究显示，肉类产品，尤其是即食牛肉制品，是SE污染的主要传播媒介（Zeaki et al., 2019）。与此同时，随着消费者需求的变化，高温加工的肉类产品因其便捷性及能满足不同口味需求而越来越受到青睐。然而，这类产品高蛋白、低碳水化合物的特性，再加上特定的加工和储存条件，可能为这些强效毒素的积累提供有利环境，进而增加食源性疾病爆发的风险（Omwenga et al., 2019; Zeleny et al., 2015）。传统的化学和物理控制方法虽可抑制微生物生长，但它们会对产品质量造成负面影响，还可能存在诱导微生物产生耐药性的问题，因此其效果有限。在此背景下，基于植物来源的生物活性化合物的生物控制方法逐渐成为一种有前景的替代方案。这些策略通过特异性靶向病原因子的调控系统来抑制毒素的表达，为预防葡萄球菌食物中毒提供了新途径（Chen et al., 2016; Yuan et al., 2022）。因此，阐明病原因子调控的分子机制对于制定精准有效的干预策略、保障食品安全至关重要。

金黄色葡萄球菌主要通过群体感应机制来调控其SEs的表达与分泌，其中辅助基因调节子(agr)系统起着核心调控作用。agr操纵子包含两个独立的转录单元：RNAII和RNAIII，分别由P2和P3启动子驱动（Li et al., 2011; Mukherjee & Bassler, 2019）。RNAII基因座编码四种核心成分：AgrA、AgrB、AgrC和AgrD。其中AgrC和AgrA构成经典的二组分系统，而AgrB和AgrD则负责生成自诱导肽信号（AIP）（Gless et al., 2019）。在AgrC/AgrA二组分途径的调控下，RNAIII既作为agr系统的效应蛋白，又对包括肠毒素和溶血素编码基因在内的多种毒力基因发挥多效性调控作用（图1A）。因此，agr群体感应系统成为调控金黄色葡萄球菌肠毒素产生的关键干预靶点。研发能够干扰细菌信号传导、抑制RNAIII转录的群体感应抑制剂（QSIs），是通过遗传手段抑制金黄色葡萄球菌中SEs的生物合成、降低其毒力表达的一种战略方法。

对agr信号传导途径的结构分析发现了多个潜在的QSIs靶点，包括AgrC的N端受体和C端组氨酸激酶结构域、AgrA的N端磷酸化位点及C端DNA结合结构域（LytTR），以及由AgrA LytTR结构域与agr操纵子形成的活性复合物（AgrA LytTR-agr复合物）（Nicod et al., 2014; Sun et al., 2012）（图1B、C）。近年来，某些天然黄酮类化合物，如木犀草素和五味子素，也被发现具有干扰AgrA功能的潜力（Qi et al., 2023; Yuan et al., 2022）。基于此，我们的研究小组发现，从苹果加工副产物中提取的二氢查尔酮类食品添加剂——黄酮素，能够有效抑制金黄色葡萄球菌中受agr调控的毒力表现，显著减少肠毒素和溶血素的生成。转录组分析进一步表明，黄酮素是通过与agr系统特异性相互作用来调控这些毒力因子的表达的。分子对接研究显示，那些缺乏黄酮类化合物典型芳香杂环C环和α-β双键的柔性黄酮类似物，如黄酮素，其多酚环能够插入AgrA LytTR结构域和agr操纵子中，从而破坏复合物的形成，抑制毒素基因的表达（Li et al., 2024）。此外，黄酮素还具有广谱抗菌、抗氧化、增强风味以及掩盖苦味等多种功能，因此被广泛用于肉类、水产品及其他食品的保鲜处理，以延长保质期并提升感官品质（Barreca et al., 2014; Hu et al., 2021; Wei et al., 2020）。然而，黄酮素与AgrA LytTR-agr复合物之间的精确结合位点以及二者分子相互作用的机制目前尚不清楚，这也限制了黄酮素作为天然QSIs在食品安全领域的系统性开发和应用。

本研究旨在探究黄酮素抑制AgrA LytTR-agr复合物形成的机制，并评估其在牛肉体系中的效果。首先，我们表达了重组的AgrA LytTR结构域并将其纯化至均一状态。随后，通过蛋白质热位移实验对黄酮素与AgrA之间的相互作用进行了全面的生物物理学表征。接着，通过电泳迁移率变动实验评估了这种相互作用的功能影响，以此定量测定其对AgrA-agr操纵子结合的抑制作用。进一步，我们结合分子对接技术和分子动力学模拟，揭示了该抑制作用的结构基础，包括结合模式以及相关的能量景观。最后，在煮熟的牛肉模型中验证了黄酮素的抗毒素活性及其广泛的保鲜潜力，从而实现了基础机制研究与实际应用的结合。总之，本研究为开发以干扰群体感应为作用机制的新型天然食品防腐剂——黄酮素奠定了理论基础。

章节要点

材料与菌种培养

黄酮素购自中国上海的Macklin Biochemical Co., Ltd.。金黄色葡萄球菌 ATCC 29213购自中国北京的楚兰生物技术研究院。大肠杆菌（E. coli）BL21 (DE3)、裂解缓冲液和洗脱缓冲液由中国上海的Sangon Biotech Co., Ltd.提供。卡那霉素、异丙基-β-D-硫半乳糖苷（IPTG）、Sypro Orange和HEPES分别来自中国上海的Beyotime Biotechnology、美国Sigma-Aldrich以及Aladdin Biochemical公司。

AgrA LytTR结构域的表达与纯化分析

含有重组质粒pET-28a(+)-AgrA LytTR结构域的表达菌株在37℃下用0.5?mM IPTG诱导培养4小时。之后收集菌细胞并通过Western blot进行分析。如图2A所示，出现了与AgrA LytTR结构域预期分子量（15.7?kDa）相对应的清晰蛋白条带，说明诱导成功（图2A）。为了提高纯化效率并检测蛋白的溶解性，我们对诱导条件进行了系统优化。

结论

本研究证实，黄酮素可通过干扰AgrA LytTR结构域与agr操纵子P3启动子之间的结合，有效抑制金黄色葡萄球菌中的agr群体感应系统。首先，我们成功表达了并纯化了AgrA LytTR结构域。TSA实验显示，经黄酮素处理后，该结构域的熔解温度T_m显著升高，表明其热稳定性得到提升。随后，EMSA实验也证实黄酮素确实抑制了这种结合反应。

CRediT作者贡献声明

李鸿：原文撰写、正式分析、数据整理。崔海英：可视化、方法设计、实验研究。Tariq Aziz：资源提供。Ashwag Shami：结果验证、资金获取。Abdelrahman R. Ahmed：文章审阅与编辑、资金获取。Fakhria A. Al-Joufi：文章审阅与编辑。林琳：项目监督、软件使用、项目管理、概念构思。

资金支持

作者感谢沙特阿拉伯利雅得努拉·宾特·阿卜杜勒-拉赫曼公主大学的大学研究人员支持项目（编号：PNURSP2026R31）的支持。此外，本研究还得到了沙特阿拉伯费萨尔国王大学科学研究处及研究生与科学研究办公室的资助[项目编号：KFU254147]。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。

Hong Li|Haiying Cui|Tariq Aziz|Ashwag Shami|Abdelrahman R. Ahmed|Fakhria A. Al-Joufi|Lin Lin